انتقال چند T-DNA به یک سلول گیاهی و تولید گیاهان تراریخته

به خاطر انتشار ژن­های مقاومت به آنتی­بیوتیک در طبیعت یا فرار ژن­های مقاومت به علف­کش به گونه­های علفی وحشی، دانشمندان به دنبال راه­حل­هایی برای تولید "گیاهان تراریخته عاری از نشانگر"[۱] هستند. این گیاهان در ابتدا بر مبنای مقاومت به آنتی­بیوتیک و علف­کش انتخاب شده ولی در مراحل بعدی دست­ورزی و رشد گیاهان، نشانگر انتخابی برداشته خواهد شد. روش­های مختلفی برای حذف نشانگر انتخابی از گیاهان تراریخته اولیه پیشنهاد شده است. این روش­ها شامل استفاده از سیستم نوترکیبی در جایگاه اختصاصی، مثل Cre-lox یا Flp-Frt برای برداشتن نشانگر، "حرکت ترانسپوزونی"[۲] نشانگر انتخابی از جایگاه اولیه خود پس از ورود به ژنوم گیاهی، به طور کامل یا به جایگاهی غیر مرتبط که در نسل­های بعدی تفرق یابد، یا بهره­برداری از چندین T-DNA که در جایگاه­های غیر مرتبط وارد شده و در مراحل بعدی تفرق یابند، می­شود.
هر کدام از این سیستم­ها مزایا و معایب خود را دارند. به طور مثال، خروج ژن نشانگر با استفاده سیستم نوترکیبی جایگاه اختصاصی، به ورود آنزیم site-specific recombinase به داخل گیاه به وسیله انتقال ژن یا تلاقی ژنتیکی نیاز دارد. تفرق نشانگرها نیز فقط در نسل­های گیاهان تراریخته رخ داده و محدود به گونه­هایی است که به طور طبیعی از طریق بذر تکثیر می­شوند و شامل گیاهان با تکثیر رویشی نمی­شود.
تحقیقات اولیه درباره الگوی تفرق T-DNA در تومورهای گال تاجی حاکی از آن است که دو T-DNA رمزشده توسط یک پلاسمید Ti نوع octopine می­توانند به طور مستقل و در برخی اوقات در چند نسخه، وارد ژنوم گیاه شوند. آنالیز مولکولی نشان می­دهد که این T-DNAها می­توانستند در جایگاه­های غیر مرتبط وارد شوند. این نتایج نشان­دهنده این موضوع است که انتقال ژن توام برای ادغام تراژن­هایی که توسط دو T-DNA مختلف حمل می­شوند، امکان­پذیر بوده و شاید این T-DNAها در نسل­های بعدی از همدیگر تفرق یابند. در نتیجه سه رهیافت برای انتقال ژن توام استفاده می­شود:
۱) ورود دو T-DNA، هر کدام از یک باکتری مختلف؛
۲) ورود دو T-DNA که توسط رپلیکون­های جداگانه در یک باکتری حمل می­شوند؛
۳) ورود دو T-DNA که در بر روی یک رپلیکون و در یک باکتری قرار گرفته­اند.
آزمایش­های اولیه با استفاده از این سه رهیافت نشان می­دهد که انتقال ژن توام تکرارپذیر است. An و همکارانش نشان دادند که می­توان انتقال ژن توام به سلول­های توتون و ایجاد دو فنوتیپ مختلف را با استفاده از یک سویه آگروباکتریوم که دارای یک پلاسمید Ti بوده (رشد مستقل از فیتوهورمون) یا یک T-DNA ناقل دوتایی T-DNA (رشد مقاوم به کانامایسین)، انجام داد. این آزمایش نمایانگر رهیافت "یک سویه، دو رپلیکون" انتقال ژن است.
وقتی سلول­ها برای مقاومت به آنتی­بیوتیک مورد انتخاب قرار گرفتند، ۱۰ تا ۲۰ درصد آنها رشد مستقل از هورمون­های گیاهی نیز نشان دادند، در حالیکه اگر انتخاب اول برای رشد مستقل از هورمون­های گیاهی انجام می­گرفت، ۶۰ درصد کلوس­های ایجاد شده، به کانامایسیم مقاوم بودند. این محققان، معتقد بودند که دلیل این تفاوت فراوانی، تعداد نسخه بیشتر (۵ تا ۱۰) ناقل دوتایی در باکتری، نسبت به تک نسخه پلاسمید Ti می­باشد.
این آزمایش­ها توسط Frammond و همکارانش ادامه یافت و آنها توانستند از بافت­های همسانه­سازی­شده توتون که به وسیله T-DNA از یک پلاسمید Ti و یک میکرو Ti[۳] (رهیافت یک سویه، دو رپلیکون) انتقال ژن به آنها صورت گرفته بود، گیاهان تراریخته بارور باززایی کنند. تفرق دو T-DNA در نتاج حاصل، نشان داد که T-DNAها در دو مکان ژنی جداگانه ادغام شده بودند. گروه­های دیگری رهیافت یک سویه، دو رپلیکون را برای تولید گیاهان تراریخته­ استفاده کردند که در ابتدا هر دو نشانگر T-DNAها ابراز شده ولی در ادامه این دو نشانگر از یکدیگر تفرق یافتند.
Depicker و همکارانش آزمایش مشابهی انجام دادند که نشانگرهای انتخابی آن، رشد مستقل از هورمون­های گیاهی و ساخت nopaline (رمزشده توسط یک پلاسمید Ti) و رشد مقاوم به کانامایسین (رمزشده توسط یک ناقل دوتایی) بود. آنها آزمایش را از دو راه انجام دادند:
۱) یا دو T-DNA با دو سویه مختلف آگروباکتریوم منتقل شدند (رهیافت دو سویه، دو رپلیکون)،
۲) یا هر دو T-DNA با یک رپلیکون در یک سویه منقل شدند (رهیافت یک سویه، یک رپلیکون). نتیجه آزمایش­ها این بود که انتقال توام T-DNAها توسط یک پلاسمید در یک سویه به طور قابل ملاحظه­ای کاراتر از انتقال توسط دو سویه متفاوت می­باشد.
استفاده از یک سویه آگروباکتریوم و انتقال توام دو T-DNA از یک رپلیکون مشابه و پیگیری تفرق ژن انتخابی تا تولید گیاهان تراریخته عاری از نشانگر، توسط Komari و همکارانش و Xing و همکارانش نیز مورد بررسی قرار گرفته است. در هر کدام از این مطالعات، محققان موفق به تولید گیاهان تراریخته عاری از نشانگر با فراوانی بالایی شده­اند.
استفاده از دو سویه مختلف آگروباکتریوم برای ارسال T-DNAهای مختلف به یک سلول گیاهی، توسط گروه­های متعددی انجام شده است. گرچه انتقال توام T-DNAها به جایگاه­های غیر مرتبط ژنتیکی گزارش شده است، اما برخی محققان نشان داده­اند که در بسیاری از موارد، پیوستگی[۴] زیادی بین T-DNAهای مختلف وجود دارد. بر این اساس، هنوز کاملاً روشن نیست که کدام یک از این رهیافت­های انتقال ژن توام، برای تولید گیاهان تراریخته عاری از نشانگر مناسب­تر هستند.

منبع : سازمان آموزش و پرورش استان خراسان