میکروسکوپ های فلورانس .نگاهی از نزدیک

اگرچه پروسه عبور نورهای میكروسكوپی تاریخچه طولانی دارد، میكروسكوپ فلورسنس بالاخره توانست كلیدی باشد برای ورود به دنیایی از ناشناخته‌ها. استفاده از مولكول‌های فلورسنس باعث شد كه مشاهده ساختارهای مختلف حتی اگر بسیار ریز باشد به كمك میكروسكوپ‌های فلورسنس امكان‌پذیر شود.
از آنجا كه مولكول‌های فلورسنس به عنوان منبع نور عمل می‌كند می‌تواند جایگاهی مطمئن و مشخص را در نمونه مورد نظر پیدا كند كه هر یك از آنها با رنگ خاصی نمایش داده می‌شود. جهت انتشار نور، این شاخص‌ها احتیاج به ذخیره انرژی در فلوركروم‌ها دارد كه این كار توسط تحریك و تزریق نور منابع نوری میكروسكوپ‌ها انجام می‌شود. پس محدوده مشخصی از طول موج‌ها نیز برای تحریك فلوركروم‌ها لازم است زیرا هر فلوروكروم دارای طیف طول موج خاصی است كه مخصوص آن فلوركروم است. به عنوان مثال طول موج رنگ آبی در محدوده ۴۸۰ نانومتر می‌تواند فلوركروم ‏FITC‏ را تحریك كند. میكروسكوپ‌ها باید حتماً به فنآوری خاصی برای مرئی كردن نور فلورسنس‌ها مجهز شود.
● مولكول‌های فلورسنس
دو گزینه برای استفاده از میكروسكوپ‌های فلورسنس وجود دارد، كه بستگی به شرایط تحقیقاتی دارد:
۱) نمونه مورد نظر خود شامل مولكول‌های فلورسنت باشد
۲) فلوروكروم باید به نمونه مورد نظر اضافه شود.‏
فلوركروم‌ها به سه گروه تقسیم می‌شود:
▪ گروه اول
برای متصل شدن به مولكول‌ها احتیاج به مولكول‌هایی مثل آنتی‌بادی‌ها و ‏Lectinها دارد. این گروه از فلوروكروم‌ها كه به‌سرعت نیز رشد می‌كند شامل مولكول‌های درازی مثل ‏FITC، ‏TRITCاست. اكثر این مولكول‌ها با هم استفاده می‌شود و شامل یك مولكول شناسایی هدف نیز می‌شود. نقاط كوانتوم نیز بخشی از این گروه را تشكیل می‌دهند كه البته ساختار و تئوری آنها با این گروه متفاوت است. آنها كریستال‌هایی در حد نانومتر است كه ساختارشان از سمی كنداكتورهای تصفیه شده تشكیل شده است.
▪ گروه دوم
دارای خاصیت ذاتی اتصال به مولكول‌ها است مثل ‏DAPI‏ اسید نوكلئیك. این گروه شامل مولكول‌های فلوركرومی است كه وقتی با مولكول‌های متفاوتی مثل كلسیم یا ‏Fura-۲‎‏ اتصال پیدا می‌كند خواص فلورسنتی خود را تغییر می‌‌دهد. این گروه معمولاً به صورت مستقیم مورد استفاده قرار می‌گیرند و به سیستم‌های نقل و انتقالی مثل آنتی‌بادی‌ها احتیاج ندارد.
▪ گروه سوم
شامل پروتئین‌های فلورسنت است كه خودشان از ارگانیسم‌هایی مثل ‏GFP‏ ساخته شده‌ است. همین امر به این گروه قابلیت استفاده شدن را در حالت‌های مختلفی مثل مطالعه روی مولكول‌های بیولوژیك ایجاد می‌كند. تمام فلوروكروم‌ها دارای خصوصیات ذاتی و ویژگی‌های خاصی است كه معمولاً می‌تواند در تحلیل مولكول‌های چند رنگ با یكدیگر تركیب شود.
● پیشرفت در زمینه فلورسنت
با پیشرفت‌هایی كه در زمینه كنترل و استفاده از فلوركروم‌ها در دهه اخیر صورت گرفته است تكنیك‌های ثبت فلورسنت در حال حاضر نقش بسیار كلیدی و مهمی در تحلیل كاركردی ارگانیسم‌ها در سطوح مختلف پوست ایفا می‌كند. این امر نه تنها به دید وسیعی احتیاج دارد، بلكه لازم است كه فن‌آوری‌های مختلفی جهت تضمین تحریك فلوركروم‌ها به روش‌های امروزی اضافه شود. در نتیجه سیستم‌های فلورسنس كه ازاین ملزومات رای تبدیل نماهای ماكرو به میكرو استفاده می‌كند می‌توانند پیشرفت‌های بسیار زیادی در زمینه تحقیقات آزمایشگاهی داشته باشد.
پیشرفت در زمینه این فن‌آوری‌ها خصوصاً میكروسكوپ‌ها بسیار مهم است. پیشرفت در این فن‌آوری‌ها در حال حاضر استفاده از روش‌های پیشرفته را در زمینه فلورسنت مخصوصاً در میكروسكوپ‌ها مقدور ساخته است و می‌توان به راحتی با ‏Zoom‏ كردن روی یك نمونه نمایی سه بعدی از ارگانیسم‌ مورد نظر را با ریزترین جزئیات به‌دست آورد.
هنگام استفاده از میكروسكوپ‌ها برای مطالعه در زمینه ارگانیسم‌ها، فواصل موجود یكی از نكات كلیدی است كه باید مورد توجه قرار گیرد. بنابراین هنگامی كه رزالوشن بسیار بالا مورد نیاز باشد میكروسكوپ‌های ماكروزوم گزینه بسیار مناسبی است و می‌تواند بین بزرگنمایی و رزولوشن به صورت تركیبی تعاون برقرار كند.
روزنه‌های بزرگ‌تر می‌توانند رزالوشن را در فلورسنس‌های درخشان بالا ببرد. در نتیجه برای اینكه سیستم ماكروزوم بتواند تصاویری فلورسنسی با كیفیت بالا داشته باشد لازم است كه از عدسی‌های خاصی كه بتواند در فواصل مختلف و رزالوشن‌های متفاوت كار كنند استفاده شود و در ضمن میزان تنگ و گشاد بودن روزنه‌های آن قابل كنترل باشد.
برای افزایش میزان باز شدن روزنه و شدت نور در هنگامی كه فاصله‌‌ها نیز اهمیت دارد. حتی موادی كه در ساخت عدسی‌ها مورد استفاده قرار گرفته است به‌طور قابل توجهی تركیبات اتوفلورسنس را كاهش داده‌ است، در نتیجه ثبت سیگنال‌های بسیار ضعیف فلورسنت نیز میسر شده است.
‏

نویسنده: مهندس سرور بهبهانی

منبع : مجله مهندسی پزشکی و تجهیزات آزمایشگاهی