کاربرد بیوتکنولوژی در آبزی پروری: انجماد اسپرم ماهی(۱)

● مقدمه
انجماد بلند مدت تکنیکی است که بواسطه ی آن می توان سلول های زنده ، بافت ها ، اندام ها ، رویان، لارو و ... را در دمای خیلی پایین (معمولا در ۱۹۶- در جه سانتیگراد ) برای یک دوره ی زمانی نامشخص ، نگهداری نمود. از این تکنیک برای نگهداری و ایجاد بانک اسپرم به منظور تکثیر مصنوعی در حیوانات پرورشی استفاده شده است. در بین ماهیان نیز کارهای پژوهشی بسیار زیادی برای انجماد اسپرم و تخمک انجام پذیرفته است.تا به امروز اسپرم قریب به ۲۰۰گونه ی ماهی به روش نگهداری در سرما، مورد سنجش قرار گرفته است .در شرایط دمایی صفر درجه سانتیگراد ، اسپرم را می توان از چند ساعت تا چند روز ، بسته به نوع گونه ی مورد آزمایش ، نگهداری نمود. با توجه به یافته های تئوریک ، با استفاده از تکنیک نگهداری در سرما، سلول های جنسی را می توان از ۲۰۰ تا ۳۲۰۰۰ سال ، بدون کاهش در کیفیت آنها نگهداری نمود ( suquet و همکاران، ۲۰۰۰) .با وجود انجماد اسپرم در بین گونه های مختلف ماهی ، تا به امروز در انجماد تجاری تخم ماهی هنوز موفقیت چندانی حاصل نشده است. اندازه ی بزرگ، ساختار پیچیده، وجود چندین غشاء با نفوذپذیری متفاوت از موانع اصلی در انجماد تخم ماهیان می باشد(Thomas،۲۰۰۳).
● مزایای انجماد اسپرم ماهی
۱) هم زمان سازی قابلیت دسترسی به هر دو جنس
برای تکثیر دو نژاد بهاره یا پاییزه یک ماهی که امکان دسترسی به هر دو جنس در یک زمان وجود ندارد، می توان از این روش بهره برد (Blaxter،۱۹۵۳).
۲) استفاده از کل حجم منی موجود
برای گونه هایی که بدست آوردن اسپرم از آنها مشکل می باشد، می توان از این تکنیک استفاده کرد(مانند مارماهی ژاپنی )(Ohta و Izawa،۱۹۹۶).همچنین برای استحصال اسپرم از گونه هایی که در شرایط اسارت اسپرم کافی تولید نمی کنند نیز می توان از این روش بهره برد(مانند فلاندر دم زرد)(Clearwter و Crim، ۱۹۹۵).
۳) آسان نمودن نگهداری مولدین
القاء تخم ریزی خارج از فصل تولیدمثل در بسیاری از گونه های ماهی پرورشی از طریق دستکاری دوره ی نوری و دمایی قابل اجراست(Bromage، ۱۹۹۵) ولی این کار پر هزینه خواهد بود(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰).زمانیکه اسپرم های منجمد شده در تمام سال وجود داشته باشد، دستکاری فصل تکثیر تنها به ماهیهای مولد ماده محدود می گردد.
۴) حمل ونقل آسان سلول های جنسی
در زمانی که سلول های جنسی مولدین را در محل های مختلف جمع آوری می کنند، با این روش جا به جایی آنها راحت تر انجام می گیرد.علاوه بر این از این روش برای معرفی ژن های مختلف از محیط طبیعی به ذخایر پرورشی نیز می توان استفاده کرد.
۱) جلوگیری از کاهش کیفیت اسپرم
کاهش کیفیت اسپرم در طول فصل تولیدمثل در بسیاری از گونه های ماهی گزارش شده است(Rana،۱۹۹۵). تکنیک انجماد اسپرم امکان جمع آوری اسپرم در زمانی که بالاترین کیفیت را دارا هستند،را فراهم می کند.
۶) حفاظت از تغییرپذیری ژنتیکی جمعیت های بومی
استفاده از تعداد محدودی از مولدین در کارگاه های تکثیر، کاهش هتروزیگوسیتی را در پی خواهد داشت. اسپرم های منجمد شده از نژادهای بهگزینی شده را می توان به ذخایرگونه های پرورشی معرفی نمود.همچنین از بانک ژنی موجود در اسپرم های منجمد شده می توان برای حفظ تنوع ژنتیکی جمعیت ماهیهای در معرض خطر و جلوگیری از آمیزش خویشاوندی استفاده کرد.
علاوه بر موارد ذکر شده، در ماهیهای هرمافرودیت پروتوژینوس(مانند هامور)، امکان بدست آوردن اسپرم تنها در سنین ۵ تا ۱۰ سالگی وجود دارد از این رو برای تکثیر مصنوعی این ماهیان داشتن ذخایر اسپرمی بسیار مفید و حتی ضروری می باشد(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰).
از سال ۱۹۵۳ که بلاکستر برای اولین بار عمل انجماد اسپرم را بر روی ماهی هرینگ به انجام رساند تا به امروز این عمل بر روی تعداد زیادی از ماهیهای آب شیرین و آب شور (بیش از ۲۰۰ گونه) مورد آزمایش قرار گرفته است. محققین کشور نیز توانسته اند با موفقیت اسپرم ماهیان خاویاری(عابدی، ۱۳۷۵)، ماهی کپور (برادران نویری، ۱۳۷۷)، ماهی سفید دریای مازندران(قاسمی، ۱۳۷۷) و قزل آلای رنگین کمان (شکیبی دریا کناری،۱۳۸۰) را در شرایط سرمایی ذخیره سازی نمایند.
مراحل مختلف انجماد اسپرم
فرآیند انجماد اسپرم را می توان به چهار مرحله ی زیر تقسیم بندی نمود:
۱) مرحله ی قبل از انجماد(جمع آوری اسپرم)
عمل جمع آوری اسپرم در طول فصل تولیدمثل مولدین صورت می پذیرد.اسپرم های استحصال شده از مولدین به لوله های سرد شده توسط یخ انتقال داده می شود. عدم آلودگی اسپرم به ادرار،مدفوع موکوس، خون و موادی از این دست ضروریست.اسپرم های جمع آوری شده برای ادامه ی مراحل انجماد در یخچال نگهداری شده و قبل از آغاز مراحل بعدی ، کیفیت اسپرم مورد بررسی قرار می گیرد. اختلاف کیفیت اسپرم در بین گونه های مختلف به تناوب در تحقیقات مختلف گزارش شده است(Rana،۱۹۹۵). دلیل این اختلافات، تفاوت ژنتیکی، محل نمونه برداری اسپرم(از داخل بیضه یا از طریق منفذ تناسلی)، آلودگی اسپرم های نمونه گیری شده با ادرار و زمان برداشت اسپرم در طول فصل تولیدمثل بیان شده است(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰) . درآزاد ماهیان(Morisawa،۱۹۸۸) و در توربوت (Suquet و همکاران، ۲۰۰۰) برداشت اسپرم از منفذ تناسلی از طریق فشار به شکم ماهی در مقایسه با روش نمونه برداری از بیضه ، اسپرماتوزوئیدها تحرک بیشتری از خود نشان می دهند. در مارماهی ژاپنی، اسپرم هایی که از داخل بیضه برداشت گردیدند بعد از فعال سازی در مقایسه با روش استحصال دستی تحرک کمتری داشتند(Ikedo و همکاران،۱۹۹۷).اسپرم های برداشت شده از بیضه بعد از اینکه در محلول نمکی با غلظت بالای پتاسیم(K+) و بی کربنات(-Hco۳) درمان گردیدند بطور مصنوعی تحرک طبیعی پیدا نموده و قابلیت لقاح مشابه با روش دیگر داشتند(Ohata، و همکاران،۱۹۹۷).
به خاطر مجاورت لوله های اسپرم و لوله های ادراری، احتمال آلودگی نمونه های اسپرم با ادرار وجود دارد. این پدیده در گونه های آب شیرین گزارش گردیده (Rana،۱۹۹۵) اما بندرت در بین گونه های دریایی دیده شده است(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰).آلودگی ادرار با اسپرم سبب کاهش درصد تحرک ، کاهش سرعت، نزول قابلیت لقاح و کاهش قابلیت نگهداری و ذخیره سازی اسپرم می شود. غلظت ادرار و زمان نگهداری اسپرم بر تاثیرات ذکر شده می افزاید. خالی نمودن میزنای کلیه قبل از عمل جمع آوری اسپرم ، به میزان ۳/۹ درصد از آلودگی اسپرم به ادرا می کاهد(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰). در گونه هایی که دارای اسپرم متراکم هستند (مانند سی باس)، به خاطر ویسکوزیته ی پایین و تغییر رنگ قسمتی از اسپرم که با ادرار آلوده گردیده، آلودگی اسپرم به ادرار به آسانی قابل تشخیص می باشد(Fauvel و همکاران،۱۹۹۹).
در بسیاری از گونه ها غلظت اسپرم با رسیدن به انتهای فصل تکثیر کاهش می یابد(Fauvel و همکاران،۱۹۹۹).اسپرم این گونه ها در ابتدای فصل تولیدمثل در مقایسه با انتهای آن دارای مدت تحرک بیشتری می باشد(Billard و همکاران،۱۹۹۹). بنابراین، میزان تحرک پایین، میزان لقاح کم و کاهش قابلیت نگهداری کوتاه مدتِ اسپرم در انتهای فصل تکثیر گزارش شده است(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰).
توجه به نکات زیر در هنگام جمع آوری اسپرم از مولدین برای حفظ کیفیت اسپرم به منظور انجماد و ذخیره سازی آنها ضروری می باشد:
۱) جمع آوری اسپرم بدون هیچ آلودگی به ادرار، مدفوع، خون یا فلس؛
۲) نگهداری اسپرم جمع آوری شده در بهترین شرایط با فراهم نمودن هوا یا اکسیژن برای تنفس در طول انجام عمل استحصال اسپرم؛
۳) نگهداری دمای اسپرم جمع آوری شده در ۴ درجه ی سانتیگراد در طول جمع آوری و انتقال در محیط کار.
البته اسپرم های جمع آوری شده از هامور مالاباری مرده که در دمای ۴ درجه ی سانتیگراد نگهداری شده بود، برای چندین ساعت کیفیت خود را حفظ نمود(Chao و همکاران،۲۰۰۰).
۲) انجماد
قبل از آغاز فرآیند انجماد نیاز به تهیه ی محلول رقیق کننده و محافظت کننده می باشد.
۲-۱) رقیق کننده
رقیق کننده ها محلول نمکی می باشند که برای رقیق سازی اسپرم استفاده می شود. شایان ذکر است که اسپرم رقیق نشده غیر قابل انجماد می باشد(Thomas،۲۰۰۳). علاوه بر وظیفه ی رقیق سازی اسپرم، جلوگیری از فعال شدن اسپرم و فراهم کردن محیطی برای اضافه نمودن محافظت کننده ها از دیگر کاربردهای این محلول می باشد.
بیشترین رقیق کننده های مورد استفاده در انجماد اسپرم در ماهیهای دریایی محلول نمکی (با غلظت ۱-۱۰ درصد) یا شکر (با غلظت ۵-۱۰ درصد) می باشد(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰). از آنجایی که تحرک اسپرم وابسته به ذخایر ATP می باشد، محلول رقیق کننده باید از حرکت اسپرم قبل از انجماد جلوگیری کند. با این وجود در توربوت به عنوان یک گونه ی دریایی ، اضافه نمودن محافظت کننده از قبیل دی متیل سولفوکسید با افزایش اسمولالیته به میزان ۱۱۰۰ میلی اسمول با ازاء هر کیلوگرم سبب القاء حرکت اسپرم به مدت کمتر از یک دقیقه می شود. این فعالیت اسپرم قبل از انجماد تاثیری بر قابلیت لقاح و تحرک آنها ندارد که احتمالا به خاطر پدیده ی سنتز دوباره ی ATP در طول فعالیت اسپرم در این ماهی می باشد(Dreanno و همکاران، ۱۹۹۷).
محلول رقیق کننده ی مونایب (ساکارز، بی کربنات پتاسیم، گلوتاتیئون و زرده ی تخم مرغ) برای انجماد اسپرم ماهیهای دریایی، روغن ماهی، سی باس، توربوت و بسیاری از ماهیهای آب شیرین مناسب تشخیص داده شده است. وجود گلوتاتیئون در این محلول از اثر تخریبی رادیکال های آزاد(Maracine و Segner ، ۱۹۹۷) و پراکسید شدن چربی ها جلوگیری کرده و از غشاء اسپرمی محافظت می کند(Baulny، ۱۹۹۷).
در ایران انجماد و نگهداری اسپرم ماهی قزل آلای رنگین کمان نشان داده که با استفاده از رقیق کننده و محافظت کننده ی با ترکیب تریس، زرده تخم مرغ، گلوکز و دی متیل سولفوکسید بهترین نتایج حاصل می گردد(شکیبی دریا کناری، ۱۳۸۰). اسپرم ماهی سفید نیز با استفاده از تکنیک انجماد اسپرم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که رقیق کننده ی Kurokura ، با ترکیب کلرید کلسیم، کربنات سدیم، کلرید منیزیم، کلرید پتاسیم، کلرید و آب مقطر بهترین محلول رقیق کننده برای انجماد اسپرم این ماهی می باشد(قاسمی،۱۳۷۷).
نسبت رقت اسپرم در رقیق کننده ها از ۱ :۱ تا ۲۰:۱ (حجم مایع منی به حجم رقیق کننده) متغیر می باشد.برای کفال مخطط و تیلاپیا نسبت ۱:۱ ، برای خامه ماهی ۴:۱ ، برای هامور ۲۰:۱ (Chao و Liao، ۲۰۰۱) ، برای قزل آلای رنگین کمان ۱: ۳ (قاسمی،۱۳۷۷) گزارش گردیده است. در ماهی هامور در زمانیکه میزان رقت منی از ۱۰:۱ به ۱۰۰:۱ تنزل پیدا کرد مدت زمان تحرک اسپرم از ۴۰ دقیقه به ۲ دقیقه کاهش یافت(Gwo، ۱۹۹۳). دلیل علمی که می توان برای تفسیر این نتیجه ارائه نمود اینست که پروتئین پلاسمای منی از قابلیت بازماندگی و بقاء اسپرم حفاظت می نماید وکاهش رقت اسپرم به بیش از ۱۰:۱ باعث کاهش تاثیر پروتئین پلاسمای منی و کاهش کیفیت اسپرم می گردد(Billard،۱۹۸۳).
۲-۲) محافظت کننده ها
این مواد شیمیایی ، آسیب های ناشی از انجماد (تشکیل بلورهای یخ)، بر روی سلول های جنسی، را به حداقل می رساند.این مواد شیمیایی سرعت انتشار آب ازداخل سلول به خارج سلول راکاهش داده و از سرعت رشد کریستال های یخی می کاهد.برای انتخاب یک محافظت کننده ی مناسب باید به نکات زیر توجه نمود:
الف) موادانتخابی باید میزان سمیت پایینی داشته باشند؛
ب‌) قابل حل در آب باشند؛
ج‌) قابلیت نفوذ به داخل سلول را دارا باشند.
معمولا محافظت کننده ها را به دو گروه نفوذ پذیر و نفوذناپذیر تقسیم می کنند.اتیلن، پروفیلن گلیکول، گلیسرول، دی متیل سولفوکسید و متانول جزء محافظت کننده های نفوذ پذیر می باشند. از جمله دلایل استفاده از این نوع محافظت کننده ها سرعت نفوذ آنها به داخل اسپرم و واکنش بین آنها با فسفولیپیدهای غشاء اسپرم بیان شده است(Baulny،۱۹۹۷). دی متیل سولفوکسید رایج ترین محافظت کننده مورد استفاده در انجماد اسپرم ماهی می باشد که قابلیت نفوذ پذیری آن متاثر از دما نیست و میزان سمیت آن بین گلیسرول که حداقل سمیت و متانول که بیشترین سمیت را داراست ، قرار دارد(Thomas،۲۰۰۳). البته غلظت بالا دی متیل سولفوکسید ((DMSO سمی بوده و مدت تحرک اسپرم برخی از گونه ها در غلظت بالای این ماده کاهش یافته است(Leung،۱۹۸۷؛ Gwo،۱۹۹۳). دی متیل سولفوکسید، گلیسرول، مخلوط دی متیل سولفوکسید و گلیسرول، پروپان ادیول، دی متیل استامین و پلی اتیلن گلیکول برای انجماد اسپرم آزاد ماهیان مورد استفاده قرار گرفت که در این میان مخلوط ۵ درصد دی متیل سولفوکسید و یک درصد گلیسرول مؤثرترین محافظت کننده گزارش گردید(Lahnsteiner، و همکاران،۱۹۹۶).در آزاد ماهیان متانول تاثیر معنی دار در انجماد اسپرم هایی دارد که نسبت اسپرم به تخم در هنگام لقاح پایین باشد(Lahnsteiner، و همکاران،۱۹۹۷).با وجود این، متانول در انجماد اسپرم ماهیهای دریایی بی تاثیر بوده و یا اثر اندکی دارد(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰).
در ماهیهای آب شیرین محافظت کننده های نفوذناپذیر ازقبیل پروتئین ها(BSA) یا لیپوپروتئین ها (زرده ی تخم مرغ)، ساکارز و گلوکز برای جلوگیری از وارد شدن آسیب به غشاء پلاسمایی رایج می باشد(Scott و Baynes، ۱۹۸۰). این مواد سبب افزایش مقاومت غشاء در برابر استرس های اسمزی و افزایش تحرک اسپرم ماهی قزل آلا رنگین کمان بعد از انجماد زدایی می شود(Rana و همکاران، ۱۹۹۸).
۲-۳) ایجاد تعادل بین اسپرم و محلول رقیق کننده
مخلوط اسپرم و محلول رقیق کننده به منظور ایجاد توازن بین ترکیبات محلول و سلول، برای مدت کوتاهی در دمای پایین نگهداری می شوند. این زمان بسته به نوع ماده ی محافظت کننده ی انتخابی متغیر می باشد. در مواردی که از مواد نفوذپذیر مانند گلیسرول استفاده می شود، به زمان بیشتری نیاز خواهد بود.با تمام این اوصاف این زمان نباید بیش از یک ساعت باشد. در غیر این صورت احتمال فعال شدن اسپرم ها در محلول رقیق کننده وجود دارد.افزایش زمان موازنه از ۵ دقیقه به ۶۰ دقیقه و افزایش غلظت DMSO از ۱۰ به ۳۰ درصد در ماهی سی باس ، سبب کاهش تحرک اسپرم بعد از خروج از حالت انجماد شده است(Gwo،۱۹۹۴). چنین اثری بعد از یک ساعت در کفال مخطط نیز دیده شده است(Chao و همکاران،۱۹۷۵). در مورد قزل آلای رنگین کمان، برای نفوذ DMSO به داخل سلول ۱۰ دقیقه زمان نیاز است. این مدت تاثیری بر روی کیفیت اسپرم ها نخواهد گذاشت(Suquet و همکاران، ۲۰۰۰). مخلوط گلیسرول و DMSO به دلیل سرعت نفوذ پایین گلیسرول به مدت زمان بیشتری برای نفوذ به داخل سلول نیاز خواهد داشت.
۲-۴) مرحله ی انجماد
معمولا از سه روش برای انجماد اسپرم استفاده می شود(Thomas،۲۰۰۳):
۱) روش پلت های یخی: این روش برای انجماد اسپرم آزاد ماهیان بطور وسیع مورد استفاده قرار گرفته است. اندازه ی پلت ها ممکن است بین ۲۰ تا ۲۰۰ میلی لیتر متغیر باشد. سرعت انجماد اسپرم در این روش ۲۰ – ۳۵ درجه سانتیگراد در هر دقیقه می باشد. مخلوط اسپرم و محلول رقیق کننده را به حفره ی های کوچکی که در یخ خشک تعبیه می شود، انتقال می دهند(دمای انجماد ۷۹- درجه سانتیگراد). گلوله های یخ ایجاد شده به این روش برای ذخیره سازی و نگهداری طولانی به نیتروژن مایع انتقال داده می شود. در این روش نیازی به نگهداری اسپرم در محلول رقیق کننده برای ایجاد تعادل و نفوذ محافظت کننده به داخل سلول نیست و می توان بلافاصله این مخلوط را منجمد نمود.
۲) روش استفاده ی از لوله های باریک
لوله های باریک (استرو) در حجم های مختلف (۲۵/۰ تا ۴ میلی لیتر) برای انجماد اسپرم مورد استفاده قرار می گیرد.این روش به دلیل حفظ کیفیت اسپرم پس از انجماد زدایی و کاهش فرصت کریستالیزه شدن دوباره ی اسپرم در طول انجماد زدایی ، در سال های اخیر رواج بیشتر ی پیدا نموده است.بعد از انتقال مخلوط اسپرم و محلول رقیق کننده به این لوله ها، ابتدا در بخار نیتروژن مایع و یا یخ خشک سرد شده و در ادامه به نیتروژن مایع انتقال داده می شود. سرعت انجماد در این روش در بین ماهیهای آب شیرین ۲۰ تا ۱۶۰ درجه سانتیگراد در هر دقیقه و برای ماهیهای آب شور بین ۵ تا ۱۵۰ درجه سانتیگراد در هر دقیقه گزارش شده است(Thomas و همکاران، ۲۰۰۳).
۳) روش استفاده از ویال یا سرنگ
برخی از محقیقین از این وسایل نیز برای ذخیره سازی و نگهداری اسپرم رقیق شده ی ماهیان استفاده نموده اند(Mounib،۱۹۷۸،برای ماهی آزاد اقیانوس اطلس و روغن ماهی ؛ Gupta و همکاران برای کپور).
۲-۵) مرحله ی ذخیره سازی
اسپرم های منجمد شده در مرحله ی قبلی را می توان در دمای ۱۹۶- درجه سانتیگراد در نیتروژن مایع برای مدت طولانی نگهداری نمود.
۳) ذوب اسپرم های منجمد شده
برای جلوگیری از تشکیل دوباره ی بلورهای یخ در سلولها ی جنسی در حین انجماد زدایی، ذوب سریع اسپرم های منجمد شده ضروریست. سرعت ذوب اسپرم در ماهیهای دریایی پایین تر از ماهیهای آب شیرین می باشد( برای ماهیهای آب شیرین ۳۰-۸۰ درجه ی سانتیگراد در هر دقیقه (Rana، ۱۹۹۵) و برای ماهیهای دریایی از ۱ تا ۴۰ درجه ی سانتیگراد در هر دقیقه(Sequet و همکاران،۲۰۰۰) گزارش شده است). بطور معمول ظروف حاوی اسپرم در حمام آب گرم و پلت های یخی اسپرم مستقیما در محلول لقاح ذوب می شوند(Lahnsteiner،۲۰۰۰). محلول لقاح مورد نیاز برای ذوب پلت های اسپرمی آزاد ماهیان از کربنات سدیم یک درصد و نمک طعام تشکیل می شود(Thomas و همکاران، ۲۰۰۳). یک پلت به ۱-۲ میلی لیتر محلول لقاح که داری دمای ۲۵-۳۰ درجه سانتیگراد می باشد، انتقال داده می شود. بعد از ۵-۱۰ ثانیه اسپرم های منجمد شده، ذوب شده و مستقیما برای لقاح تخمک ها مورد استفاده قرار می گیرند. کمترین تراکم اسپرم مورد نیاز برای لقاح مناسب تخمک ها ۱۰۶×۳ اسپرم به ازاء تخمک گزارش گردیده است(Thomas و همکاران، ۲۰۰۳). لوله ی باریک حاوی اسپرم های منجمد شده نیز در حمام آب گرم با دمای ۳۰-۴۰ درجه سانتیگراد قرار داده می شوند. از میکروویو نیز برای ذوب لوله های باریک حاوی اسپرم های منجمد ماهی هامور استفاده شده که نتایج خوبی از آن بدست آمده است. ویال های حاوی اسپرم منجمد نیز به ۶۵-۷۰ ثانیه زمان نیاز دارند تا اسپرم ها به حالت اولیه برگردند. محاسبات نشان می دهد که ویال حاوی ۳ میلی لیتر اسپرم برای لقاح ۱۰۰ الی ۱۵۰ هزار تخمک کفایت می کند(Thomas و همکاران، ۲۰۰۳).
ذوب اسپرم های منجمد شده از مهم ترین مراحل فرآیند انجماد اسپرم می باشد و تخطی از شرایط نرمال و اپتیمال باعث کاهش معنی دار درصد لقاح تخم می شود. به عنوان مثال اگر زمان انجماد زدایی برای ۵ ثانیه و یا دمای مورد نیاز برای ذوب اسپرم آزاد ماهیان و اردک ماهی ۵ درجه سانتیگراد تغییر کند، میزان باروری این اسپرم ها به طور معنی داری کاهش می یابد(Lahnsteiner،۲۰۰۰).
بعد از اینکه اسپرم ها از حالت انجماد خارج شدند، باید بلافاصله مورد استفاده قرار گیرند. در ماهی توربوت یک ساعت بعد از انجماد زدایی از اسپرم، با وجود نگهداری آنها بر روی خرده های یخ، میزان تحرک اسپرم ۳۵ درصد کاهش یافت(Dreanno و همکاران، ۱۹۹۷). البته شایان ذکر است که قرار دادن اسپر م های ذوب شده در داخل مایعی شبیه به مایع منی، قابلیت نگهداری کوتاه مدت اسپرم را افزایش می دهد(Sequet و همکاران،۲۰۰۰).
قبل از استفاده ی از اسپرم های ذوب شده باید به نکات زیر توجه شود:
۱) تعیین تحرک اسپرم به عنوان راهنمایی برای برآورد موفقیت لقاح؛
۲) کاهش زمان بین ذوب کردن اسپرم های منجمد شده و انجام عمل لقاح؛
نسبت رقت اسپرم: از آنجایی درصد موفقیت لقاح در ارتباط با غلظت اسپرم می باشد و از طرف دیگر تمام اسپرم های منجمد شده در طول فرآیند انجماد کیفیت خود را حفظ نمی کنند، لذا لازم است که در هنگام انجام عمل لقاح میزان تراکم اسپرم های ذوب شده بالاتر از اسپرم های تازه باشد.

منابع
۱- کلباسی، محمدرضا،جزوه ی درسی تکثیر و پرورش تکمیلی آبزیان، دوره ی کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس،۱۳۸۲.
۲-کیوان شکوه، سعید، مروری بر عملکرد پژوهشی دانشگاه ها و مراکز تحقیقات علوم شیلاتی در زمینه ژنتیک آبزیان در ایران، سمینار کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده ی علوم دریایی نور، ۱۳۸۰.
۳- Babiak, I., Glogowski, J., Brzuska, E., Szumiec, J., Adamek, J.,
Cryopreservation of sperm of common carp, Cyprinus carpio L. Aquac.
Res. ۲۸, ۵۶۷–۵۷۱, ۱۹۹۷.
۴- Blaxter, J.H.S., Sperm storage and cross fertilization of spring and autumn spawning herring. Nature ۱۷۲:۱۱۸۹-۱۱۹۰, ۱۹۵۳.
۵-Holtz, W., cryopreservation of rainbow trout sperm: practical recommendations. Aquaculture, ۱۱۰:۹۷-۱۰۰, ۱۹۹۳.
۶-Lanhnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R.A., Methanol as cdyoprotectant and the suitability of ۱/۲ ml and ۵ ml straw for cryopreservation of semen from salmonid fishes, Aquaculture Research, ۲۸, ۴۷۱-۴۷۹,۱۹۹۷.
۷- Lanhnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R.A., A uniform method for cryopreservation of semen of the salmonid fishes Oncorhynchus mykiss, Salmo trutta fario, Salmo trutta, Coregonus sp., Aquaculture Research, ۲۶:۸۰۱-۸۰۷,۱۹۹۵.
۸- Mounib, M. S., Cryogenic preservation of fish and mammalian spermatozoa.J.Repord. Fertil.۵۳:۱۳-۱۸, ۱۹۷۸.
۹-Rana, K. ۱۹۹۵. Preservation of gametes in Broodstock Management and Egg and Larval Quality. N. R. Bromage and R. J. Roberts, editors. University Press, Cambridge, England. Pp. ۵۳–۷۵.
۱۰- Suquet, M., Dreanno, C., Fauvel, C., Cosson, J., Billard, R., Cryopreservation of sperm in marine fish. Aquaculture Research,۳۱:۲۳۱-۲۴۳, ۲۰۰۰.
۱۱-Thomas, P.C., Rath, S.C., Mohapatra, D.K. Breeding and seed production of Fin fish and Sellfish. Daya puplishing house. ۲۰۰۳.
سید مرتضی ابراهیم زاده
دانش آموخته ی دانشگاه تربیت مدرس-مقطع کارشناسی ارشد