سرما و نگهداری جنین ماهیان (انجماد جنین)

در حال حاضر وضعیت بسیاری از آبزیان از جمله ماهیان و مرجان ها در جهان در مرحله بحران است. جزایر مرجانی یکی از اجتماعات زیستی در معرض خطر و بسیار با ارزش در جهان هستند که هم اکنون بخاطر صدمات ناشی از آلودگی و گرم شدن کره زمین در حال مرگ می باشند. به تازگی یک مؤسسه معتبر جهانی گزارش کرده که نزدیک به ۷۰ تا ۹۰ درصد ذخایر ماهیان اقیانوسی بیش از حد صید می شوند و یا در حداکثر میزان مجاز صید می گردند.
مسئله اینجاست که میزان صید ناوگان صیادی ۴۰ درصد بیشتر از توان بازسازی اقیانوس هااست. این امر بخاطر از بین رفتن پناهگاه ها و صدمه به محیط و آلودگی و فقدان وسیله دفاع در برابر شکارچیانی است که توسط انسان وارد آب ها شده اند و از همه مهمتر بخاطر صید بی رویه می باشد.
علاوه بر ماهیانی که مقدار صیدشان بسیار کاهش یافته، نسل بسیاری از ماهیان نیز در حال انقراض است.
به طور معمول آبزی پروری یکی از راههای جبران کمبود بعضی از ماهیان و بازسازی ذخایر بعضی دیگر است. قابلیت تولید افزون تر ماهیان پرورشی یا حفاظت از گونه های در معرض انقراض ماهیان می تواند بوسیله انجماد جنین بهبود یابد. تکنیک نگهداری جنین در سرما روشی است که بطور گسترده در لقاح خارج از رحم وانتقال جنین، هم در آزمایشگاههای انسانی و هم در مجتمع های دامپروری استفاده می شود.
انجماد جنین یا محافظت توسط سرما عبارت است از:« تعویض آب درون جنین با یک ماده غیر قابل انجماد».
در حال حاضر بر خلاف جنین پستانداران، جنین ماهیان بدلیل مشکل بودن خارج سازی آب از داخل جنین و وارد کردن یک محلول ضد انجماد به داخل زرده آن به راحتی منجمد نمی شود.
اگرچه انجماد و محافظت از اسپرم بسیاری از ماهیان استخوانی بوسیله سرما هم اکنون با موفقیت انجام شده است اما هنوز انجماد جنین و تخمک ماهیان گنگ و مبهم است.
تلاش های فراوانی برای انجماد تخمک لقاح نیافته ماهیان نیز صورت گرفته است که تا بحال موفق نبوده است که دلیل آن مشکل آبگیری از تخمک بخاطر اندازه نسبتاً بزرگ آن و تروایی متفاوت غشای آن است. علاوه بر ماهیان تحقیقاتی روی مرجان ها صورت گرفته که نشان داده در مورد مرجان ها بر خلاف ماهیان نیازی به استفاده از ترکیب ملکولی برای تعادل غشاء جنین وجود ندارد و بنابر این انجماد جنین مرجان ها بزودی انجام پذیر خواهد شد.
جنین ماهیان پیچیدگی بیشتر واندازه بزرگتری نسبت به جنین پستانداران دارد و شامل یک زرده بزرگ است که مواد غذایی را برای جنین فراهم می نماید، در صورتیکه جنین پستانداران در طی تکامل مواد و انرژی مورد نیاز خود را توسط جفت از مادر می گیرد.
بعنوان مثال در پستانداران گلوکز توسط این کانال به جنین می رسد و بنابر این بنظر می رسد که همین کانال برای ورود مواد حفاظت کننده جنین بوسیله سرما به داخل جنین مناسب باشد زیراکه که بسیاری از این مواد ضدانجماد و محافظت کننده از نظر شیمیایی جزو قندها می باشند. این در حالی است که جنین ماهیان فاقد چنین کانال انتقالی است که در پستانداران یافت می شود واین یکی از مشکلات انجماد جنین درماهیان است.
● انجماد جنین ماهیان چه فوایدی دارد؟
امروزه ماهی یکی از مشهورترین مواد غذایی مصرفی در جهان است که بعنوان غذای اصلی بیش از یک میلیارد انسان همه ساله از دریاها ورودخانه ها صید می شود که بخاطر صید بی رویه وشرایط بد محیطی برای تکثیر طبیعی، در حال حاضر جمعیت بسیاری از گونه ها ی ماهیان روبه نابودی است و برای تأمین ماهی بعنوان غذا یکی از راه ها پرورش گونه های مختلف چه بمنظور مصرف انسانی و چه برای بازسازی ذخایر محیط های طبیعی می باشد.
از آنجا که تولید مثل طبیعی بسیاری از ماهیان در تمام فصول قابل انجام نیست و بعضاً فقط سالی یکبار تولید مثل می کنند، کمبود میزان تخم و لارو برای پرورش یکی از مهمترین مشکلات آبزی پروران می باشد. حال با تکنیک انجماد جنین می توان جنین ماهیان را برای مدت دلخواه و بصورت سالم در سرما نگهداری کرد ودر زمان مورد نیاز، از جنین های ذخیره شده استفاده کرد و درتمام طول سال جنین های جوان ولاروهای سالم در دسترس خواهد بود که این امر در بهبود تولید آبزیان مؤثر خواهد بود.
انجماد جنین اجازه خواهد داد که که ژن های گونه های مختلف در حداقل فضا نگهداری شود تا ژن های با ارزش برای انتقال ژن و دورگه گیری استفاده شود. از طرف دیگر هم اکنون نسل گونه هایی از ماهیان رو به انقراض است و با تکنیک انجماد جنین می توان جنین این ماهیان را تا مدت ها در بانک های ژن ذخیره کرد تا در زمان انقراض این گونه ها امکان احیاء مجدد نسل آن ها میسرباشد.
قابلیت انجماد جنین ماهیان همچنین ممکن است به متخصصین ژنتیک و پزشکان کمک کند که درباره نقش ژن های منفرد در بیماری های انسان مطالعه کنند.
ماهیان و بخصوص ماهیان گورخری یکی از مشهورترین مدل های مورد استفاده در شناسایی عملکرد ژن های انسان هستند. اگرچه اندازه ژنوم ماهی گورخری (Brachydanio rerio) کوچکتر از ژنوم انسان است، اما ترتیب ژن های آن به ترتیب ژن های انسان شباهت دارد و همتای آن است.
اگرچه بیشتر ژن های انسان هم اکنون شناخته شده اند اما محققین هنوز عملکرد خیلی از ژن ها را نمی دانند، که توسط ماهیان گورخری می توانند نقش این ژن ها را کشف کنند. علاوه بر شباهت ژنوم انسان و ماهی گورخری، تهیه ماهیان گورخری ساده و ارزان است، مراقبت از آن ها آسان است و براحتی تکثیر می شوند؛ همچنین تجدید نسل آن ها سریعتر از پستانداران است و بنابر این جزئیات بیشتری در زمان کوتاهتر قابل فهمیدن است. در این مورد با استفاده از تکنیک انجماد می توان جنین های حاصل از یک نسل ماهیان گورخری را برای آزمایشات متوالی تا مدت ها نگهداری کرد و در زمان نیاز از آن ها استفاده نمود.
در یک تحقیق مدون، هدف فهمیدن قابلیت نفوذپذیری جنین ماهیان استخوانی نسبت به آب و مواد ضد انجماد بود تا بتوان به یک روش انجماد جنین نه چندان پیچیده و ارزان قیمت دست یافت که برای بسیاری از گونه های ماهیان قابل انجام باشد. روش های معمول انجماد جنین از آنجا چندان موفق نبوده اند که اطلاعات کمی درباره نفوذپذیری جنین که از مهمترین عوامل موفقیت انجماد جنین است، دربر داشته اند.
در اینجا از یک فرکانس مغناطیسی(MR) میکروسکوپی بر روی ماهیان گورخری استفاده شد که اینکار منجر به اندازه گیری دقیق ترکیبات سلولی از قبیل آب ها و مایعات و چربی های سلولی و تحرک آن ها می شود و نیز باعث مشاهده مستقیم فعالیت هایی از قبیل تراوایی محلول ها از میان غشاء می گردد. در ابتدا قابلیت نفوذ قسمت های مختلف جنین شامل زرده و بلاستودرم نسبت به مواد منجمد کننده گوناگون در دوره های مختلف تکامل جنین بدست آمد.
در دوازدهمین ساعت تکامل جنین، اجزاء آن نسبت به یک ماده منجمد کننده بنام دی متیل سولفوکسید(DMSO) تراوا هستند ولی کل جنین تراوا نمی باشد. شاید غشاء کیسه زرده که زرده را احاطه کرده بعنوان ناقلی برای ورودDMSO باشد.
در اینجا از روش منفذ سازی ملکولی در غشاء استفاده شد که منافذ انتقالی آبی را شکل می دهد تا میزان نفوذپذیری غشاء را بدون اینکه سبب تغییرات غیر معمول در حین تکامل شود، افزایش دهد. اگر غشاء بتواند قابل نفوذ شود، انجماد جنین یک هدف دست یافتنی خواهد بود. در بررسی قابلیت نفوذ جنین ماهیان استخوانی نسبت به مواد منجمد کننده معلوم شد که یک لایه بین زرده و بلاستودرم ایجاد می شود به نام Yolk Syncytical Layer (YSL) که بطور قابل ملاحظه ای مانع ورود مواد منجمد کننده به داخل زرده می شود.
همین لایه میتواند عامل عدم موفقیت انجماد جنین در گذشته باشد. تحقیقاتی برای افزایش تراوایی YSL باید انجام شود تا مواد منجمد کننده بتوانند وارد زرده شوند. هم زرده و هم بلاستودرم نسبت به مواد آب به میزان یکسانی نفوذپذیرند اما نسبت به موادی که برای انجماد جنین بکار می روند تراوایی متفاوتی دارند و نفوذ پذیری زرده خیلی بالاتر از نفوذ پذیری بلاستودرم است.
تحقیقاتی نیز بر روی پتانسیل انجماد اووسیت ماهی (سلول هایی که تولید تخم می کنند) انجام شده است. اووسیت هنوز توسط لقاح فعال نشده است. طی لقاح یک اسپرم وارد تخمک می شود ودر غشاء پلاسمایی تخمک ادغام می شود. قابلیت نفوذ اووسیت ماهی ممکن است راه حلی برای انجماد جنین باز کند. اووسیت ماهی بتدریج در داخل تخمدان رسیده می شود و نسبت به مایع تخمدانی قابل نفوذ است؛ اما وقتیکه وارد محیط کم فشار یا پرفشار می شود، اووسیت رسیده از شوک اسمزی پرهیز می کند.
اگر در طی لقاح یک توده کلسیم از تخم عبور کند، تولید اووسیت قابل نفوذ می نماید. در یک بررسی هدف مطالعه مسدود کننده های کلسیمی بودکه از فعالیت اووسیت جلوگیری می کنند و در نتیجه اووسیت نسبت به آب و مواد منجمد کننده نفوذپذیر می ماند. هدف دیگر این بررسی این بود که آیا اووسیت رسیده ماهی گورخری می تواند در حضور مسدود کننده کلسیمی بارور شود؟ در این صورت این اووسیت رسیده لقاح یافته نفوذ پذیر، بعنوان یک نامزد مناسب برای انجماد جنین می باشد. در این موردباید میزان نفوذپذیری آب و مواد منجمد کننده و میزان انرژی اکتیواسیون اووسیت های لقاح یافته نفوذپذیر اندازه گیری شود(اینکار انجام شده ولی اطلاعات آن در دسترس نیست).
در بررسی های دیگر سعی شده است که مواد منجمد کننده مستقیماً بوسیله Microinjection به داخل زرده تزریق شوند واثر این کار بر تکامل جنین ماهی گورخری بررسی شود(اینکار هم انجام شده).
در ادامه یکی از کارهای انجام شده دررابطه با نگهداری جنین بوسیله سرما توضیح داده میشود:
«تفریخ جنین های کپور معمولی نگهداری شده در&#۷۳۰;c۲- و &#۷۳۰;c۴ در غلظت های مختلف متانول و ساکاروز»
● خلاصه:
عمل تفریخ جنین های کپور معمولی بعد از ۱۲ و ۷۲ ساعت نگهداری در دمای &#۷۳۰;c۲- و &#۷۳۰;c۴ ، با استفاده از غلظت های مختلف ساکروز (۰.۱و۰.۲۵و۰.۵و۱.۰ مولار)، متانول(MeOH) (۰.۵و۱.۰و۱.۵و۲.۰و۲.۵و۳.۰و۳.۵ مولار) و یا غلظت های متفاوت متانول در ۰.۵ مولار ساکروز، آزمایش شد.
برای ساکروز ۰.۵ مولار ماکزیمم بقاء %۴۱-۱ در طی ۱۲ ساعت تا %۱۱-۰.۲ در طی ۷۲ ساعت در &#۷۳۰;c۴ مشاهده شد. در &#۷۳۰;c۲- با هیچ یک از غلظت های ساکروز، هیچگونه بقایی مشاهده نگردید. در هر دو درجه حرارت با ترکیبی از متانول ۱.۵ مولار و ساکروز۰.۵ مولار تفریخ جنین ها بالا بود و در واقع ترکیب ۱.۵ مولار(۴.۸%) متانول با ۰.۵ مولار(۱۷.۱۰%) ساکروز، در میان تمام غلظت های امتحان شده در هر دو درجه حرارت منجر به بهترین نتیجه شد.اینطور بیان شده است که نگهداری جنین ماهیان گورخری با استفاده از پروپیلن گلیکول در نیتروژن مایع حتی برای یک دقیقه منجر به آسیب دیدن میتوکندری و بهم خوردن ساختار ریبوزوم و غشاء پلاسمایی دور زرده(YSL) می شود.
همچنین%۱۰۰ جنین ماهیانی مثل کپور معمولی و ماهی گورخری که حتی برای یک زمان کوتاه در نیتروژن مایع قرار گرفته بودند از بین رفتند. از طرفی Zhang و همکاران گزارشی از موفقیت انجماد جنین کپور معمولی ارائه کرده اند؛ اگرچه این نتایج تکرار نشده است.RosenthalوWhittingham نشان دادند که وقتی جنین هرینگ توسط DMSO یا دی متیل سولفوکسید(Me۲SO) محافظت می شود و تا c۱۰- سرد می گردد، هیچ جنینی زنده نمی ماند.
مطالعات فراوانی برای یافتن ماده مناسب جهت انجماد جنین در بهترین حالت در حرارت پائین انجام شده است.
Zhang و همکاران دریافتند که متانول نسبت به دی متیل سولفوکسید یا اتان دیول تأ ثیر بیشتری در انجماد جنین ماهی گورخری دارد. گزارش شده که متانول در عرض ۱۵ دقیقه به داخل جنین نفوذ می کند، در صورتیکه سایر منجمد کننده ها بعد از ۲.۵ ساعت یا اصلاً وارد زرده نمی شوند یا تنها کمی وارد زرده می شوند. بنظر می رسد که در طی تکامل جنین ماهی گورخری در c۲۲ میزان قابلیت نفوذ متانول کاهش بیابد.
گزارش شده که استفاده از اولتراسوند قابلیت نفوذ جنین ماهی گورخری را افزایش می دهد. با این وجود ثابت شده که تا مرحله ۶ تکامل جنین ماهی گورخری متانول نفوذپذیری محدودی به داخل جنین دارد ولی در مراحل بعدی جنین نفوذپذیر نمی باشد. دی متیل سولفوکسید منجمدکننده خوبی برای جنینOryzias latipes می باشد. در کپور معمولی تا مرحله مورولا ساکروز و DMSO، تا مرحله نیمه Epiboly متانول و ساکروز و DMSOوتا مرحله ضربان قلب متانول و گلیسرول بعنوان محافظت کننده در سرما مناسب تشخیص داده شده اند.
میزان حساسیت به سرما و نفوذپذیری مواد منجمد کننده در جنین مرحله Dechorinated ماهی گورخری بررسی شده و نشان داده که در مرحله جنین ۶ سومیتی مقداری نفوذپذیری نسبت به متانول ۲ مولار دیده شده ولی در جنین ۳ سومیتی نفوذپذیری مشاهده نگردید. همچنین معلوم شد که محلول های DMSO و متانول و پروپیلن گلیکول تا ۳۰ دقیقه سمی نیستند ولی بیشتر از این زمان سمی می شوند و نیز محلول ۱.۵ مولار گلیسرول و اتیلن گلیکول سمی بود.
وقتیکه جنین ماهی گورخری Brachydanio rerio به سرعت از حرارت حساس عبور می کند، میزان حساسیت آن نسبت به سرما کاهش می یابد.
با مطالعه میزان حساسیت در مرحله تحریک پذیری نسبت به سرما در بسیاری از گونه های ماهیان مشخص شده که مرحله بعد از گاسترولاسیون کمترین حساسیت را نسبت به سرما دارا می باشد. همچنین معلوم شده است که مرحله ساعت ۲۴- ام در جنین های کپور معمولی درc۲- و c۴ مناسب است که برای دوره ۱۴ روزه انجماد با استفاده از متانول ۰.۲ مولار به همراه تری هالوز ۰.۱ مولار بعنوتن محیط حفاظت کننده بکار می روند.
مطالعات مقدماتی برای نگهداری جنین ماهی در حرارت کمتر از c۶- نشان داده که این حرارت پایین حتی برای یک دوره ۲۴ ساعته نیز نمی تواند مناسب باشد. نگهداری کوتاه مدت جنین حتی در یک فضای کوچک با استفاده از یخچال های ساده و انتقال این جنین ها قابل انجام است. در مطالعه اخیر هدف مشخص کردن تأثیر نگهداری کوتاه مدت(۱۲ تا ۷۲ ساعته) با استفاده از غلظت های مختلف مواد منجمد کننده و دماهای c۲- و c۴ بر روی عملکرد تفریخ جنین کپور معمولی با استفاده از دماهای رایج در یک یخچال بود:
برای اینکار تخمک های لقاح یافته کپور معمولی از یک مزرعه تکثیر ماهی جمع آوری شد که با استفاده از روش استاندارد تزریق هیپوفیز از مولدین تخمک گیری شد و تخمک های حاصله در تانک هایی که با آب چاه تصفیه شده و در حال هوادهی مشروب می گردید، قرار داده شدند. این تخمها به تفریخگاه آزمایشگاه منتقل شدند ودر آب محیط پرورش با دمای c۱۹- ۱۸ قرار گرفتند. ۱۲ ساعت پس از لقاح تخمک ها از آب تفریخگاه خارج شدند و برای آزمایش استفاده گردیدند. تخم های لقاح یافته کپور معمولی در c۱۸، ۱۲ ساعت پس از لقاح به مرحله تشکیل جنین می رسند.
در این آزمایش سه تیمار ترتیب داده شد: یکی درc۲- و c۴ برای تعیین غلظت ساکروز، دومی در c۴ با استفاده از متانول و یا متانول و غلظت انتخابی ساکروز و سومی در c۲- با استفاده از متانول و یا متانول و غلظت انتخابی ساکروز.
جنین های تهیه شده تقسیم شدند به گروه کنترل و گروه بررسی اثر سرما. گروه کنترل کنترل دوباره تقسیم شد به کنترل معمولی و کنترل سرد شده. گروه کنترل معمولی بدون تیمار شیمیایی و شوک سرد بود و جنین ها مستقیماً به تفریخ گاه منتقل شدند که دمای آب آن برابر دمای محیط (c ۱۹- ۱۸) بود. هر دو گروه کنترل و گروه تیمار تشکیل شده بودند از سه ظرف شیشه ای مشابه که هرکدام از آن ها شامل ۱۰۰ عدد جنین بودند.
انواع تیمار ها عبارت بودند از:
۱) متانول(MeOH) (۰.۵و۱.۰و۱.۵و۲.۰و۲.۵و۳.۰و۳.۵ مولار یا ۱.۶و۳.۲و۴.۸و۶.۴و۸.۰و۹.۶و۱۱.۲ درصد)
۲) ساکروز(S) (۰.۱و۰.۲۵و۰.۵و۱.۰ مولار یا ۳.۴۲و۸.۵۵و۱۷.۱۰و۳۴.۲ درصد)
۳) ترکیبی از متانول و ساکروز(غلظت ساکروز در c۴به میزان ۰.۵ مولار بهترین نتیجه را داد).
محلول ها با استفاده از آبی که دوبار تقطیر شده بود تهیه شدند. همچنین جنین ها در آب زیرزمینی تصفیه شده با فیلتر کربن نگهداری شدند (آب زیر زمینی از میان فیلتر ذغالی عبور داده می شد).
در ابتدا جنین ها در شیشه ساعتی قرار داده شدند و آب سطحی آنها خشک شد و بعد از آن محیط آزمایشی قطره قطره و به آرامی اضافه شد و برای مدت ۴۵ دقیقه در دمای محیطی c۱۹- ۱۸ نگه داشته شد.
سپس محیط آزمایشی بیرون ریخته شد و جنین ها به سرعت در لوله های تمیز ml۱۰ قرار داده شدند و محیط آزمایشی جدید و تازه قطره قطره و به آرامی اضافه شد. حجم محیط آزمایشی در هر لوله، هر بار ml ۸ بود. یعنی یکبار ml۸ متانول، یکبارml ۸ ساکروز و یکبار ترکیبی از ml۴ متانول وml ۴ ساکروز اضافه شد (در حالت سوم متانول و ساکروز با حجم برابر ترکیب شدند).
در مرحله بعد لوله های محتوی جنین تدریجاً در دو مرحله ۳۵ دقیقه ای سرد شدند:
ابتدا بوسیله غوطه وری لوله های محتوی جنین در حمام آب cº۲که درجه حرارت آن با استفاده از آب یخ cº۲ کنترل می شد؛ دوم با نگهداری لوله ها در یخچال در cº۲ و cº۲- که حرارت آن بصورت خودکار کنترل می شد. سپس جنین های تیمار شده در یخچال های جداگانه cº۴ و cº۲- قرار داده شدند و در دوره های زمانی متفاوت (۱۲ تا ۷۲ ساعت) نگهداشته شدند.
در پایان دوره نگهداری، لوله های حاوی جنین از یخچال ها خارج شدند و به سرعت در حمام آب cº۳۷ گرم شدند. سپس بطور دقیق با آب زیرزمینی تصفیه شده که هم دمای محیط (cº۱۹-۱۸) بود شسته شدند و سرانجام به تفریخگاه آزمایشی منتقل شدند که کاملاً با آب زیرزمینی در حال هوادهی (۷.۴-۷.۳=pH) پر شده بود. در این مدت میزان تفریخ در کنترل بود. تمام داده ها از لحاظ آماری با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه و تست LSD ارزشیابی شدند تا هرگونه تفاوت مشخص در پاسخ تفریخ نسبت به تیمار و دوره زمانی معلوم شود. سطح معنی دار بودن اختلافات برابر P<۰.۰۵ بود.
بررسی اطلاعات نشان داد که درصد تفریخ جنین های نمونه شاهد بین %۴۴ تا % ۴۵ بود. جنین ماهیان نمونه آب کنترل (بدون تیمار شیمیایی امّا با شوک سرد) که بمدّت ۱۲ تا ۷۲ ساعت در آب cº۴و cº۲- نگهداری شده بودند، %۱۰۰ مرگ و میر نشان دادند. میزان تفریخ جنین های حفاظت شده با مواد منجمد کننده مشابه در دماهای cº۴و cº۲- متفاوت بود و معلوم می شود که دمای نگهداری جنین ها بر روی موفقیت تفریخ جنین های منجمد شده کپور معمولی مؤثر است. از آنجا که دمایی مشابه دمای محیط در طی دوره جمع آوری جنین برای حرارت های مورد آزمایش (cº۴و cº۲-) حاکم بود، هر دو آزمایش از ارزش مشابه برخوردار بودند.
در cº۲- ، انجماد جنین توسط متانول۰.۵ و۱.۰ مولار مناسب نبود. با افزایش درجه حرارت میزان تفریخ جنین های نگهداری شده در cº۴بالاتر از cº۲- بود. یک ارتیاط کاملاً واضح بین دمای نگهداری و غلظت مولی مناسب نگهدارنده ها مشاهده شد. سمیت منجمد کننده ها در دماهای پایین تر کمتر است. با این وجود در هر دو دما، مقدار تفریخ با افزایش دوره نگهداری از ۱۲ ساعت تا ۷۲ ساعت، کاهش می یافت. Zhang و Rawson مشاهده کردند که بقای جنین های فوق سرد شده ماهی گورخری با افزایش زمان نگهداری و کاهش درجه حرارت کاهش می یابد و وقتی جنین ها بمدّت ۷۲ ساعت در cºصفر، یا بمدّت ۱ ساعت در cº۲۰- قرار می گیرند هیچ بقایی در آن ها دیده نمی شود.
علاوه بر آن فهمیده شد که لازم است غلظت متانول را از ۱ مولار به ۵ مولار برسانیم تا بتوانیم دمای انجماد را از cº۰و cº۱۵- کاهش دهیم. ضمناً متانول ۱.۵ مولار که در cº۴ بعنوان یک منجمد کننده خوب شناخته شده، ممکن است درcº۲- نتیجه مشابهی برای تفریخ نداشته باشد. برای اینکه در دو درجه حرارت مختلف به میزان تفریخ مشابهی دست یابیم، نیاز به استفاده از غلظت بالاتری از متانول در cº۲- نسبت به cº۴ داریم. یا به عبارت دیگر در غلظت ثابتی از متانول، میزان تفریخ در cº۲- پایینتر از cº۴ است. ممکن است که غلظت بالاتر متانول باعث محافظت بیشتر در برابر شوک سرمایی بشود. بنابر این غلظت بالاتر متانول از آسیب ناشی از سرما به جنین کپور معمولی در هنگام کاهش حرارت جلوگیری می کند.
در هنگام آزمایش غلظت ساکروز به تنهایی، ممکن است که پاره شدن غشاء زرده منجر به مرگ و میر دسته جمعی شود. امّا با افزودن متانول از این پاره شدن جلوگیری می شود؛ زیرا که متانول نقطه انجماد محلول های انکوباسیون را کاهش می دهد. غلظت ۱ مولار متانول برای cºصفر، ۲ مولار برای cº۵- ، ۳ مولار برای cº۱۰- و ۵ مولار برای cº۱۵- بعنوان محافظت کننده در برابر سرما بهترین تأثیر را دارد.
افزودن ۰.۵ مولار ساکروز به ۳ مولار متانول منجر به %۳ تا %۶ افزایش میزان تفریخ در cº۲- می شود؛ زیرا به زنده ماندن جنین در طی سرد شدن کمک می کند. مطالعات نشان می دهد که در جنین پستانداران، قندها از عواقب ناشی از آبگیری(دهیدراسیون) جلوگیری می کنند.
با حضور ساکروز میزان سمیت مواد منجمد کننده کاهش می یابد. ساکروز باعث آبگیری آرام وملایم از سلول می شود و همین امر از غشاء سلول در زمان کاهش درجه حرارت محافظت می کند. با این وجود غلظت نسبتاً بالای ساکروز(۰.۱مولار) به تنهایی، باعث مرگ و میر %۱۰۰ جنین های کپور معمولی بعد از ۱۲ ساعت نگهداری می شود.
درضمن غلظت بالای ساکروزموجب آبگیری سریع از سلول و چروکیده شدن آن می شود که در نهایت موجب مرگ جنین می شود.
معلوم شده است که فاکتور مهم وضروری برای موفقیت انجماد جنین دارای ضربان قلبِ ماهی گورخری در دمای پایین، یکی غلظت ماده منجمد کننده و دیگری دمای نگهداری است که هردوی اینها لازم وملزوم یکدیگرند.
در جنین دارای ضربان قلب ماهی گورخری، غلظت غیر سمی مواد منجمد کننده معادل ۲ مولار متانول، ۲ مولار دی متیل سولفوکسید، ۲ مولار اتان دیول، ۱ مولار گلیسرول و ۰.۵ مولار ساکروز است. در تخم چشم زده قزل الای رنگین کمان نیز ارتباط بین غلظت دی متیل سولفوکسید با زمان رویارویی با حرارت cº۱۰ مشخص شده است. همچنین معلوم شده است که میزان بقای جنین Gold fish به مرحله تکامل آن بستگی دارد و میزان بقا در مرحله تشکیل قلب بیشتر از مرحله اپتیکال وزیکول است.
از مطالعه اخیر معلوم می شود که نگهداری جنین کپورمعمولی در درجه حرارت پایین بیشتر از ۷۲ ساعت هم به دمای نگهداری و هم به غلظت مواد منجمد کننده بستگی دارد. با این وجود تحقیقات بیشتری لازم است که این روش را استاندارد کند و تأثیر افزایش زمان نگهداری جنین کپورمعمولی در حرارت پایین را مشخص نماید. تحقیقات بیشتر در مورد سایر مراحل تکامل جنین و دیگر مواد منجمد کننده و دوره های زمانی گسترده تر باید انجام گیرد.

مترجم: صبا اصغری

منبع : علوی