رشد و تمایز سلول های مزانشیمی روی داربست هیدروکسی آپاتیت در مهندسی بافت استخوان

بهترین گزینه برای اعمال جراحی ارتوپدی استفاده از پیوند استخوان autologous برای تحریك استخوان سازی و تثبیت ایمپلنت می باشد؛ در حالیكه تعداد محدودی استخوان برای autograft (بافت خود فرد) موجود است و احتمال ایجاد مشكلات زیادی در محل دهنده وجود دارد. Allografts ( بافت فرد دیگر) از بانك استخوان در حال حاضر راه كار دیگری است ، اما احتمال بالای عواقبی چون بیماری graft-versus-host و انتقال بیماری های عفونی و در نتیجه پس زدن بافت وجود دارد. بنابراین استفاده از یك روش جایگزین مورد تحقیق قرار گرفته است. كشت سلول های استخوان زا روی داربست متخلخل می تواند یك راهكرد جدید برای پیوند استخوان با استفاده از سلول های مزانشیمی خود شخص باشد.
۱) ساختار استخوان
اولین قدم در مهندسی بافت استخوان و غضروف ، بررسی ساختار و عملكرد این سلول ها در سلسله مراتب مختلف است. استخوان از یك قالب یا ماتریس آلی محكم تشكیل شده كه بوسیلهٔ رسوب املاح كلسیم تقویت می شود. [۱] املاح متبلوری كه در ماتریس آلی استخوان رسوب می كنند اصولاَ از كلسیم و فسفات تشكیل شده اند و فرمول املاح متبلور اصلی كه هیدروكسی آپاتیت ها نامیده می شوند، بقرار زیر است: Ca ۱۰ (Po۴) ۶ (OH) ۲ .هر بلور كریستال حدود ۴۰۰ آنگستروم طول، ۱۰ تا ۳۰ آنگستروم ضخامت و ۱۰۰ آنگستروم پهنا دارد و به شكل یك صفحه مسطح بلند است. نسبت كلیسم به فسفر در شرایط تغذیه ای مختلف بسیار متغیر بوده و بر اساس وزن بین ۳/۱ تا ۲ تغییر می كند.
هر فیبر كلاژن از قطعات تكرار شونده به فاصلهٔ هر۶۴۰ آنگستروم در طولش تشكیل شده است. بلورهای هیدروكسی آپاتیت در مجاورت هر قطعه از فیبر قرار گرفته و محكم به آن میچسبند. (شكل ۱) این اتصال نزدیك از لغزیدن كریستالها و فیبرهای كلاژن بر روی یكدیگر و خارج شدن از محل خود جلوگیری می كند وبرای تأمین استحكام استخوان ضروری است.
۱) هیدروكسی آپاتیت
هیدروكسی لاپاتیت كه اغلب هیدروكسی آپاتیت نامیده می شود، یك ماده معدنی و از اشكال طبیعی كلسیم آپاتیت است و بطور طبیعی در استخوان ، دندان و مرجان های دریایی یافت میشود. فرمول هیدروكسی آپاتیت Ca۵(PO۴)۳(OH) است كه اغلب به صورت Ca۱۰(PO۴)۶(OH)۲ نوشته می شود كه مشخص كننده دو مولكول در هر واحد سلول می باشد. [۶ و ۵]
در بین خواص و ویژگی های هیدروكسی آپاتیت به عنوان یك بیومتریال ، مهمترین ویژگی را می توان زیست سازگاری عالی آن دانست.[۷] در واقع هیدروكسی آپاتیت زیست فعال است . زیست فعال بودن یك ماده توانایی آن ماده را برای اتصال به بافت زنده بدون ایجاد لایه كلاژنی بیان می كند. علاوه بر زیست سازگاری عالی ، به نظر میرسد كه هیدروكسی آپاتیت پیوند شیمیایی مستقیمی با بافت های سخت برقرار می كند.
۲) مهندسی بافت استخوان
یكی از مسائل پیش روی جراحی ارتوپدی بازسازی عیوب اسكلتی است ، گرچه این عیوب با نمونه های آلوگرافتی استخوان قابل ترمیم است ، اما پتانسیل شكست بالا باعث شكست استخوانی می گردد.مهندسی بافت علم طراحی و تولید بافت های جدید برای ترمیم اندام های آسیب دیده و جایگزین قسمت های از دست رفته به علت عوامل مختلف است. در بین بافت های بدن ، استخوان پتانسیل بالایی برای تولید مجدد دارد و از این رو یك نمونه مناسب برای مهندسی بافت به شمار میرود.
پیوند استخوان ، سالیان متمادی به وسیله جراحان ارتوپدی استفاده شده است . برای درمان یك شكستگی استخوان ، سلول های سازنده استخوان به ماتریس برای رشد و اتصال مواد معدنی و پروتئین های تولید شده نیاز دارند. در حالت عادی كه شكستگی رخ می دهد ،فضای شكستگی را لخته های خون و بافت همبند پر می كند كه برای رشد استخوان لازم هستند. اما در شكستگی ها و عیوب بزرگ ، این روند درمان كه توسط بدن انجام می شود كارساز نبوده و پیوند استخوان لازم می شود. فاكتور های مؤثر در پیوند استخوان در شكل زیر نشان داده شده اند (شكل ۳ ). اولین گزینه استفاده از استخوان خود فرد (autograft ) است كه معمولا از استخوان لگن خاصره گرفته شده به محل مورد نظر پیوند زده می شود. مقدار تقاضا برای پیوند از خود فرد از منبع موجود تجاوز می كند چون تنها برداشت نمونه های كوچك از بیمار امكان پذیر است. مشكل بزرگ دیگر احساس درد و رنج بیمار در محل دهنده ، پس از عمل جراحی است.
شكل ۳ – فاكتور های مؤثر در پیوند استخوان. از آنجاییكه تنها سلول های زنده قادر به تولید استخوان جدید هستند ، موفقیت هر پیوند استخوان مستلزم داشتن تعداد سلول استخوان زا كافی در محل است. یك پیوند استخوان ایده آل باید بتواند یك قالب استخوانی برای تجمع و رسوب استخوان ایجاد كند. فاكتورهای رشد osteoinductive ، كه در استخوان طبیعی انسان وجود دارند، با تحریك سلول های بنیادی یا سلول های استخوانی نابالغ به رشد و بالغ شدن ، استخوان را شكل می دهند.
در autograft مدت زمان جراحی و در نتیجه هزینه ها و ریسك برای بیمار افزایش می یابد.از allograft ( كه استخوان انسان دیگر پیوند زده می شود) امروزه اغلب در جراحی های مفاصل پروستتیك استفاده می شود. پیوندXenograft اكثرا آپاتیت گاوی یا خوكی و مرجان های دریایی است. این بافت ها مشكلاتی از قبیل كم دوامی ، استحكام مكانیكی غیر قابل پیش بینی و ریسك انتقال بیماری را دارند. یك آیئن نامه اروپایی استفاده از آنها را در آینده نزدیك محدود خواهد كرد.
۳.۱ ) فاكتورهای osteoinductive
فاكتور رشد بزرگترین خانواده از osteoinductive ها است . پروتئین های مورفوژنیك (BMP ) از همه مهمتر هستند. دشواری تهیه كردن و گران بودن مشكلات آن است. در پیوند سلول های بنیادی ، انتقال سریع پس از برداشتن از ستیغ خاصره مهم است. نشان داده شده است كه تكثیر سلول های بنیادی تا پنج برابر اثر مثبتی در پیوند داشته است. اخیرا افزایش رشد استخوان در اوایل دوره درمان در اثر استفاده از bisphosphonates گزارش شده است. مطالعات حیوانی نیز اثر مثبت هورمون پاراتیروئید و BMP ها را در روند پیوند نشان داده اند. BMP ها استخوان را در محیط in vivo متمركز می كنند. [۸]
۳.۲ ) پیوندهای سینتتیك osteoconductive
اغلب از گروه های كلسیم فسفات ها و كلسیم سولفات ها هستند. اولین بار در ۱۸۹۲ كلسیم سولفات توسط Dressman استفاده شد. امروزه به دلیل استحكام مكانیكی كم و بازجذب سریع در طی ۶ تا ۱۲ هفته ، تمایل چندانی برای استفاده از آن در شكستگی های استخوان نمی باشد. در كاربردهای كلینیكی ، osteoconductive باید استحكام فشاری بیشتر از ۲۵Mpa داشته باشد. زمان تزریق بین ۲ تا۶ دقیقه بوده و زمان setting آن كمتر از ۱۰ دقیقه باشد. تعدادی از فسفات ها با اضافه شدن آب و accelerator های مختلف ، فسفات جامد می شوند مانند هیدروكسی آپاتیت. Osteoconductive در ساختارهایی با تخلخل بالا ساخته می گردد و بطور مكانیكی ترد هستند ، از این رو مواد كامپوزیتی برای مهندسی بافت در حل بررسی هستند. [۸]
بهترین گزینه برای اعمال جراحی ارتوپدی استفاده از پیوند استخوان autologous برای تحریك استخوان سازی و تثبیت ایمپلنت می باشد. در حالیكه تعداد محدودی استخوان برای autografting موجود است و احتمال ایجاد مشكل در محل دهنده زیادی وجود دارد [۱۰]. Allografts از بانك استخوان در حال حاضر راه كار دیگری است ، اما احتمال بالای عواقبی چون بیماری graft-versus-host و انتقال بیماری های عفونی و در نتیجه پس زدن بافت وجود دارد. [۱۳ ، ۱۲ ، ۱۱ ] بنابراین استفاده از یك روش جایگزین مورد تحقیق قرار گرفته است.
كشت سلول های استخوان زا روی داربست متخلخل می تواند یك راهكرد جدید برای پیوند استخوان با استفاده از سلول های مزانشیمی خود شخص باشد. در تحقیقی افزایش و گسترش و تمایز سلول های مزانشیمی را بر داربست های هیدروكسی آپاتیت با اندازه تخلخل ۲۰۰ و ۵۰۰ میكرومتر با هم مقایسه می كنیم. سلول های مزانشیمی را به روش استاتیك و در spinner flasks برای ۱ ، ۷ ، ۱۴ و ۲۱ روز كشت داده و قابلیت تمایز ، تكثیر و توزیع سلول ها را در واحد حجم داربست آنها بررسی و مقایسه می كنیم . نرخ سرعت تمایز سلول های osteogenic با با سنجش فعالیت آلكالین فسفات و زنجیره پلیمری real-time reverse transcriptase برای ۱۰ سلول osteogenic نشان دار شده ، مشخص می شود. سرعت رشد سلول ها و تعداد سلول ها در داربست توسط مقدار DNA در تصویرهای SEM و میكروسكوپ فلوئورسانس مشخص می گردد. [۱۴]
۳) رشد و تمایز سلول های مزانشیمی روی داربست هیدروكسی آپاتیت
در مهندسی بافت استخوان، یك استراژی كشت سلول های osteogenic روی داربست متخلخل است. هدف ارائه یك راه حل جدید برای پیوند استخوان با استفاده از سلول های مزانشیمی خود فرد می باشد. سلول های مزانشیمی انسان را می توان از مغز استخوان برای افزایش و گسترش و تمایز در استئوبلاست ها در محیط in vitro استخراج كرد، كه یك منبع سلول قابل توجهی است. تمایز سلول های مزانشیمی انسان با مجموعه پیچیده ای از هورمون ها و فاكتورهای transcription كه از میان آنها Cbfa۱ [۱۵] و osterix [۱۶] مهمتر هستند ، كنترل می شود.
كشت سلول های مزانشیمی انسان روی داربست های ۳D به دلیل ضعف توزیع غذا و اكسیژن رسانی به بخش مركزی داربست و حتی پخش و توزیع سلول ها ،آسان نیست. این مشكل سایز داربست را در روش كشت استاتیك محدود میكند چون سلول ها تنها می توانن حدود‌اً در عمق m µ ۲۵۰ رشد كنند. [۱۷،۱۸]روش های كشت دینامیك مختلفی مورد بررسی قرار گرفتند تا بر مشكل نفوذ غلبه كنند : كشت روی orbital shaker [۱۹] ، rotating wall vessel bioreactors [۲۰،۲۱ ،۲۲] ، spinner flasks [۲۲،۲۳] و bioreactors [ ۲۳ ، ۲۴] . در تحقیقات مختلفی نشان داده شد كه این روش ها اثر مثبتی بر تكثیر و تمایز سلول ها دارند.
مطالعات زیادی بیومتریال های متخلخل ۳D با ویژگی های ساختاری و شیمیایی مختلف را برای ترمیم بافت استخوان مورد بررسی قرار دارند. هیدروكسی آپاتیت از جمله موادی است كه ویژگی های مناسب را دارد و در فرم های مختلف، مورد تایید FDA قرار گرفته است و در حال حاضر به عنوان پركننده استخوان كاربرد كلینیكی دارد. نسل بعدی ، پركننده های استخوان اسفنجی می توانند به عنوان داربست برای مهندسی بافت استخوان باشند. پارامترهای مهم داربست تخلخل و اندازه سوراخ مناسب هستند. طراحی داربست هایی كه برای پیوند استخوان بكار می روند، تقلیدی از ساختار میله میله استخوان با سایز تخلخل های ۲۰۰ و ۹۰۰ میكرومتر است. اندازه تخلخل برای غذا رسانی سلول ها ، چسبندگی سلول ها ، رشد و در نتیجه تمایز دراری اهمیت است. [۲۵ ، ۲۶ ]
هدف بررسی اثر كشت دینامیك و اندازه تخلخل های داربست روی سلول های بنیادی مغز استخوان انسان است. در اینجا از hMSC– telomerase reverse transcriptase(TERT) كه فنا ناپذیر و امكان تمایز دارند استفاده می شود. [۲۷ ،۲۸ ] از داربست هایی با تخلخل ۲۰۰ و ۵۰۰ میكرومتر استفاده می شود. سلول های مزانشیمی روی داربست ها به دو روش استاتیك و دینامیك كشت داده شده و توزیع و پخش ، تكثیر و تمایز سلول ها بررسی می شوند.
۴.۱ ) داربست
داربست از یك core از كلسیم كربنات با لایه ای نازك از هیدروكسی آپاتیت در لایه خارجی تر تشكیل شده است. قطر داربست ۱۰mm ، ارتفاع آن ۲mm و با یك hole مركزی ۱.۵mm است. دو نوع داربست با تخلخل های میانگین ۲۰۰ و ۵۰۰ میكرومتر استفاده شد. تصاویر CTµ و SEM داربست را میتوانید در شكل ۴ ببینید. رزولوشن تصاویر CTµ با ۴۰CTµ ، ۱۶ µm است. با CTµ تخلخل داربست های با اندازه سوراخ ۲۰۰ و ۵۰۰ میكرومتر به ترتیب %۷۵ و %۷۸ تعیین شد.(شكل ۴A و ۴B ) مساحت سطح دیواره داربست در واحد حجم هیدروكسی آپاتیت ۵۶ و ۸۱ mm-۱ برای داربست های با تخلخل ۲۰۰ و ۵۰۰ میكرومتر مشخص شد . [۱۴]
تصاویر SEM از داربست نشان می دهند كه داربست با تخلخل ۲۰۰-µm دارای تخلخل های با قطر۱۰۰-۲۰۰µm ( شكل ۴C ) و داربست با تخلخل ۵۰۰-µm دارای تخلخل های با قطر ۳۰۰-۵۰۰µm( شكل ۴D ) هستند. دیواره داربست با بلورهای سوزنی شكل در مقیاس نانو پوشیده شده است كه احتمالاً هیدروكسی آپاتیت هستند. (شكل ۴E ) [۱۴]
۴.۲ ) كمیت DNA
DNA از داربست استخراج می شود چون مقدار DNA متناسب با تعداد سلول ها است. بدین گونه میتوان تكثیر سلول ها را پیگیری كرد. ( شكل ۵ ) در روز ۱ تعداد سلول بیشتری به داربست با تخلخل ۵۰۰-µm ، ۱۰۹% ، نسبت به داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، %۷۴ ، چسبیده بود ( به ازای هر ۱۰۶ سلول تقریبا µg ۷ DNA داریم). برای كشت استاتیك در هر دو نوع داربست كاهش سطح DNA یا ثابت ماندن در ۱۴ روز اول دیده می شود. برای كشت استاتیك ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm در روز ۲۱ به نصف روز ۱ كاهش یافته است و داربست با تخلخل ۵۰۰-µm در روز ۲۱ كمی بیشتر از روز ۱ است.
در كشت دینامیك ، مقدار DNA برای داربست با تخلخل ۲۰۰-µm در طول دوره ثابت ماند و در روز ۲۱ بیشتر از كشت استاتیك است. به نظر می رسد كه كشت دینامیك در و داربست با تخلخل ۵۰۰-µm اثر بیشتری بر تكثیر سلول ها دارد چون مقدار DNA در طول دوره افزایش یافت. این امر با تعداد سلول بیشتر در روز ۱۴ و ۲۱ در هر دو روش كشت نشان داده شده است. در مقایسه داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ،داربست با تخلخل ۵۰۰-µm سطح DNA بالاتری در روز ۱۴ و ۲۱ در هر دو روش كشت دارد. سطح DNA در تمام نقاط زمانی برای داربست با تخلخل ۵۰۰-µm بدون توجه به روش كشت بالاتر است( برای روز ۷ ، ۱۴ و ۲۱ ). [۱۴]شكل ۵ – كمیت DNA . داربست ها دارای تخلخل ۲۰۰ و ۴۰۰ میكرومتر و تحت هر دو شرایط كشت ، استاتیك و دینامیك، برای ۱ ، ۷ ، ۱۴ و ۲۱ روز بررسی شدند ( n=۴ ).
▪ بار سفید : داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت استاتیك .
▪ بار سیاه : داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت دینامیك .
▪ بار خاكستری : داربست با تخلخل ۵۰۰-µm، كشت استاتیك .
▪ بار راه راه : داربست با تخلخل ۵۰۰-µm، كشت دینامیك.
مقدار DNA در هر µg داربست نشان داده شده است. تفاوت واضحی بین كشت دینامیك و استاتیك در داربست با تخلخل یكسان در هر زمان مشخص و همچنین بین داربست با تخلخل های متفاوت در یك روش كشت دیده می شود.
۴.۳ ) فعالیت ALP
فعالیت ALP یكی از معمولترین ماركرهای استئوژنز است و برای سنجش تمایز سلول های استخوان سازی بكار می رود. این فعالیت بعد از یك مدت زمان مشخص به پیك می رسد و دوباره كاهش می باید. در شكل ۷ ، فعالیت ALP ترسیم شده است. در روز اول داربست با تخلخل ۵۰۰-µm در مقایسه با ۲۰۰-µm، فعالیت ALP بالاتری دارد. برای داربست با تخلخل ۲۰۰-µm در كشت استاتیك فعالیتALP بطور یكنواخت از روز ۱ تا ۲۱ افزایش یافت. در روش كشت spinner flask در داربست با تخلخل۲۰۰-µm ، فعالیت ALP در روز ۱۴ به حداكثر رسید كه تفاوت فاحشی با كشت استاتیك دارد. در داربست با تخلخل ۵۰۰-µm ، فعالیت ALP در روش كشت spinner flask نیز در روز ۱۴ به حداكثر رسید ولی تفاوت چندانی با نمونه های كشت استاتیك ندارد.به علاوه در مقایسه داربست ها با تخلخل ۲۰۰-µm و ۵۰۰-µm در روزهای ۷ و ۱۴ در كشت spinner flask ، داربست با تخلخل۲۰۰-µm ، فعالیت ALP بالاتری دارد. سطح ALP در روزهای ۷ ، ۱۴ و ۲۱ بدون در نظر گرفتن روش كشت برای داربست با تخلخل ۵۰۰-µm پایین تر است. [۱۴]
شكل ۶ – ALP activity سلول های مزانشیمی با هر µg DNA در داربست نرمالیزه شده است. داربست ها دارای تخلخل ۲۰۰ و ۴۰۰ میكرومتر و تحت هر دو شرایط كشت ، استاتیك و دینامیك، برای ۱ ، ۷ ، ۱۴ و ۲۱ روز بررسی شدند ( n=۴ ).
▪ بار سفید : داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت استاتیك .
▪ بار سیاه : داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت دینامیك .
▪ بار خاكستری : داربست با تخلخل ۵۰۰-µm، كشت استاتیك .
▪ بار راه راه : داربست با تخلخل ۵۰۰-µm، كشت دینامیك.
تفاوت واضحی بین كشت دینامیك و استاتیك در داربست با تخلخل یكسان در هر زمان مشخص و همچنین بین داربست با تخلخل های متفاوت در یك روش كشت دیده می شود.
۴.۴ ) بافت شناسی
به منظور تعیین كردن چگونگی توزیع سلول ها در داربست ، از قسمت مركزی داربست قسمتی را برش داده و رنگ امیزی كردند و سپس تصاویری توسط میكروسكوپ فلوئوررسانس تهیه شد. تصاویر از بخش فوقانی تا تحتانی مقطع مركزی داربست تهیه شده اند. (شكل ۷ ) تفاوت آشكاری بین كشت دینامیك و استاتیك در هر دو نوع داربست در روز ۲۱ مشاهده می شود.
همچنین شكل نشان می دهد كه تعداد سلول بیشتری در داربست با تخلخل ۵۰۰-µm در نقاط زمانی مورد بررسی وجود دارد. در روز ۲۱ كشت استاتیك داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، لایه نازكی از سلول ها در محیط بیرونی داربست و تعداد بسیار كمی سلول در بخش مركزی داربست وجود دارد. به علاوه ، نتایج بافت شناسی مشخص می كند كه در كشت استاتیك داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، تعداد سلول ها از روز اول تا بیست و یكم كاهش یافته اند. از سوی دیگر ، افزایش تعداد سلول ها در روش كشت دینامیك از روز اول تا بیست و یكم در داربست با تخلخل ۲۰۰-µm مشاهده می شود و تعداد زیادی سلول در قسمت مركزی داربست موجود است. با مقایسه شكل های ۷D و ۷E معلوم می شود كه در كشت استاتیك داربست با تخلخل ۵۰۰- µm ، تعداد سلول ها ثابت مانده است. مانند داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، تعداد سلول ها در كشت دینامیك از روز اول تا بیست و یكم افزایش قابل توجهی داشته و تعداد زیادی سلول در بخش مركزی داربست وجود دارد. [۱۴]
شكل ۷ – تصاویر از مقطع مركزی داربست می باشند. (A) روز ۱ ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، (B) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت استاتیك (C) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت دینامیك ، (D) روز ۱ ، داربست با تخلخل ۵۰۰-µm ، (E) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۵۰۰-µm ، كشت استاتیك ، (F) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۵۰۰-µm، كشت دینامیك
SEM ( ۴.۵
جهت بررسی مورفولوژی سلول ، از سطح فوقانی داربست تصاویر SEM تهیه شده است (شكل–۸ ) . در روز اول تفاوت آشكاری بین داربست های با تخلخل ۲۰۰-µm و ۵۰۰-µm وجود دارد. تعداد سلول بیشتری در داربست با تخلخل ۵۰۰-µm وجود دارد (شكل ۸D) و شروع به تشكیل سطح سلول ها نموده در حالیكه سلول ها در داربست با تخلخل ۲۰۰-µm از هم منفك ترند (شكل ۸A) . در روز ۲۱ از كشت استاتیك ، یك صفحه نازك از سلول ها و ماتریكس داربست های با تخلخل ۲۰۰-µm (شكل ۸B ) و ۵۰۰-µm (شكل ۸E) پوشانده است . در روز ۲۱ كشت دینامیك ، لایه ضخیمی از سلول و ماتریكس خارج سلولی در دو داربست با تخلخل ۲۰۰-µm و ۵۰۰-µm وجود دارد. در شكل های ۸G و ۸H تصاویر close-up چسبندگی سلول ها را به ماتریكس نشان می دهند. این شكل ها معلوم می كنند كه در هر دو داربست با تخلخل ۲۰۰-µm و ۵۰۰-µm در روز اول نقاط كانونی اتصال سلول ها در سطح زبر و خشن بلورهای هیدروكسی آپاتیت است كه با جزئیات در شكل ۴E نشان داده شده بود. اغلب بلورهای هیدروكسی آپاتیت در درون تخلخل های داربست واقع می شوند و تمایلی به قرار گرفتن در مقاطع برش بالا و پایین ندارند. [۱۴]
شكل ۸ – تصاویر SEM از سطح فوقانی داربست . مقیاس ۴۰۰-µm برای اشكال A تا F . (A) روز ۱ ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، (B) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت استاتیك (C) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm ، كشت دینامیك ، (D) روز ۱ ، داربست با تخلخل ۵۰۰-µm ، (E) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۵۰۰-µm ، كشت استاتیك ، (F) روز ۲۱ ، داربست با تخلخل ۵۰۰-µm، كشت دینامیك. مقیاس ۵۰-µm برای شكل G و ۹۰-µm برای شكل H . پیكان های سفید در این دو شكل مشخص كننده كانون چسبندگی هستند. (G) روز ۱ ، داربست با تخلخل ۲۰۰-µm و (H) روز ۱ ، داربست با تخلخل ۵۰۰-µm
۴.۶ ) نتیجه گیری
دو روش كشت و داربست هایی با دو اندازه تخلخل مختلف بررسی شده قابلیت تمایز ، تكثیر و توزیع سلول ها را در واحد حجم داربست آنها بررسی و مقایسه كردیم . به این نتیجه رسیدیم كه داربست های با تخلخل m µ ۲۰۰ دارای نرخ سرعت تمایز سلول های استخوان زا بالاتری نسبت به داربست های با تخلخل m µ ۵۰۰ هستند و از طرفی در داربست های با تخلخل m µ ۵۰۰ سرعت رشد سلول ها بیشتر و تعداد سلول بیشتری نیز در داربست وجود دارد. بنابراین میكرو تخلخل های یك داربست ۳D بیومتریال میتواند برای كنترل سلول های مزانشیمی انسان به منظور خاص بكار رود. همچنین پی بردیم كه روش كشت دینامیك spinner flasks باعث افزایش تكثیر ، تمایز و توزیع و پخش سلول ها در داربست می شود. پس كشت دینامیك spinner flasks یك سیستم ساده برای استفاده و هزینه معقول برای كشت سلول های مزانشیمی انسان روی داربست های ۳D در اندازه های كوچك تا متوسط می باشد. مطالعاتی در محیط in vivo لازم است تا معلوم شود كدام MSC/scaffolds برای كاربردهای كلینیكی مناسب می باشد. [۱۴]

گیتا خلیلی مقدم