بیماری تیلریوز Theileriosis

استراتژی مراقبت از بیماری تیلریوز در بیشتر کشورها بوسیله کنترل ناقلین بخصوص کنه ها میباشد. اما کنترل کنه ها نسبت به روشهای دیگر کنترل این بیماری از اهمیت کمتری برخوردار میباشد. از دیگر روشهای کنترل بیماری استفاده گسترده از واکسیناسیون میباشد.

بیماری تیلریوز یکی از معضل های مهم پیشرفت در صنعت دامداری در اکثر نقاط جهان میباشد . انگلهای تیلریا ‏T. annulata و T. parva مهمترین گونه های اقتصادی و مسئول تلفات و کاهش تولید تخمین زده شده اند.

استراتژی مراقبت از بیماری تیلریوز در بیشتر کشورها بوسیله کنترل ناقلین بخصوص کنه ها میباشد. اما کنترل کنه ها نسبت به روشهای دیگر کنترل این بیماری از اهمیت کمتری برخوردار میباشد زیرا اولا کنه کش ها ( سموم Acaricide ) گران تمام میشوند و ثانیا مقاومت بر علیه اکثر آنها ایجاد شده است. در ضمن مدیریت حمل ونقل و قرنطینه دام بطور جدی قابل اجرا نمی باشد. از دیگر روشهای کنترل بیماری استفاده گسترده از واکسیناسیون میباشد. درمان داروئی معمولا با Parvaquone, Buparvaquone, Halofuginone, برای هر دو گونه ‍T. parva, T. annulata موثر میباشد. اما این درمانها دام مبتلا را مبرا از آلودگی Sterilise نمیکنند.

● واکسنهای مورد لزوم :

برای تهیه واکسن برای T. annulata از تیره سلولی شیزونت Schizont-infected cell lines استفاده میشود. این واکسن که حاوی سلولهای شیزونتی میباشد باید تا کمی قبل از مصرف در دمای انجماد نگهداری شود.

برای واکسینه کردن دامها بر علیه T. parva از روش آلوده کردن و درمان استفاده میشود. بصورتیکه مقداری کنه آلوده جمع آوری شده از روی بستر را چرخ کرده و عصاره آنرا زیر پوستی تزریق میکنند و بلا فاصله بطور همزمان درمان با تتراسیکلین را شروع میکنند. معمولا یک عفونت خفیف یا پنهان ایجاد میشود که با پاسخ ایمنی کنترل میشود.

● تشخیص بیماری و مشخصات انگل :

تشخیص بیماری وابسته به علائم کلینیکی ، شناختی از شدت بیماری و گستردگی ناقلین یا کنه ها و بررسی لامهای تهیه شده ( گسترش خون و یا گسترش غدد لنفاوی ) میباشد. غیر از فرمهای مختلف داخل گویچه قرمزی در گسترشهای خونی، شیزونت مشخصه مهم و خوبی در آلودگی با گونه های ‏T. Parva و T. annulata درگسترشهای تهیه شده از غدد لنفاوی میباشد. سلولهای آلوده ممکن است در گسترشهای فشاری Impression smears تمام بافتها دیده شوند.

● بیماریزایی: شیزونت گونه T. parva ابتدا در مرحله پاتوژنیک باعث افزایش سلولهای سیستم لنفاوی Lymphoproliferative شده و بعد از آن باعث تخریب سلولهای فوق Lymphodestructive میشود. حیوان مبتلا دارای علائم تورم غدد لنفی، تب، مقداری افزایش تنفس، تنگی نفس و گاهی اسهال میباشد. ضایعات بعد از مرگ شامل تورم و پرخونی غدد لنفاوی، ذات الریه بینابینی Interstitial pneumonia و ادم مابین لبی interlobular oedema ، ضایعات تخریشی erosion , ulcer در شیردان و التهاب روده بهمراه نکروز غدد پیرز peyer´s patches و در حالتهای طولانی تر نفوذ سلولهای لنفاوی lymphocytic infiltration به کلیه ها که شبیه سکته کلیوی infarct بنظر آمده و یا بهمراه ترمبوز و ischaemic necrosis میباشد. در حیوانات بهبود یافته گاهی در اثر عود بیماری سندرم عصبی چرخش Turning sickness دیده می شود.

خصوصیات بیماری زایی در اثر شیزونت T. annulata تقریبا شبیه ‍T. parva می باشد ولی مرحله پیروپلاسمی ممکن است پاتوژنیک تر بوده و باعث کم خونی و زردی شود.

● تکنیکهای تشخیصی :

تیلریا انگل تک یاخته أی اجباری داخل سلولی تمام خانواده گاوهای وحشی و اهلی ( Bovidae ) در جهان میباشد. و بعضی از گونه ها نشخوارکنندگان کوچک را نیز مبتلا می نماید. بوسیله کنه های خانواده Ixodidae منتقل میشوند و دارای زندگی پیچیده ای در مهره داران و بی مهره ها میباشند. شش گونه تیلریا گاو را آلوده میکند که دو تا از آنها بیماری زایی بیشتری دارند : اولی بنامT. parva که بیماری East coast fever , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis را ایجاد و دومی T. annulata باعث بیماری Tropical theileriosis میشود.

دیگر گونه ها که شامل T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutans هستند معمولا بیماری زایی خفیفی ایجاد میکنند. گونه T. velifera غیر بیماری زا است. اغلب این گونه ها پس آلوده کردن دام ایجاد دام ناقل در دامهای بهبود یافته را مینمایند اما هیچ نوع داده وآماری در رابطه با رل این ناقلین در انتقال بیماری در حالت طبیعی وجود ندارد.

گاوهای بومی درمناطق بومی آلوده ممکن است بیماری را تحمل نموده و یا به بیماری خفیف و تحت کلینیکی مبتلا شوند. اما گاوهای غیر بومی حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شدیدی نشان داده و یا تلف می شوند.

همانطوریکه قبلا هم گفته شد شیزونت ها در گسترش تهیه شده از غدد لنفاوی مشخصه خوبی برای آلودگی با T. parva, T. annulata میباشد. شیزونت گونه T. taurotragi در گسترش رنگ آمیزی شده بوسیله گیمسا بخوبی قابل تشخیص نمیباشد.شیزونت T.mutans نسبت به شیزونت T. parva دارای هسته های بزرگتر، مسطح وبی قاعده میباشد.

فرم پیروپلاسمی T. parva , T. annulata و T. mutans شبیه بهم میباشد. اما معمولا T. annulata , T. mutans بزرگتر و اغلب در حال تقسیم دیده میشود. T. velifera ممکن است بوسیله یک پرده حجاب مانند تشخیص داده شود.

● تشخیص سرولوژیکی :

تشخیص وجود پادتن بصورت غیر مستقیم بوسیله IFA ( indirect fluorescent antibody)

بطور گسترده برای تشخیص گونه های مختلف تیلریا بکار می رود. تشخیص نوع آلودگی بخصوص آلودگی با ‍T. parva چندان در بین روشهای ایمنولوژی قابل تمایز نمی باشد. بهترین روش سرولوژی قابل تمایز مابین گونه های تیلریا آزمایش غیر مستقیم پادتن فلورسانس IFA ( Indirect Fluorescent Antibody ) می باشد. در این آزمایش هر دو مرحله شیزونت و پیروپلاسمی بوسیله لام تهیه شده و یا در محلول قابل بررسی می باشند. برای نگهداری محلول یا لامهای تهیه شده در مرحله شیزونتی دمای انجماد (۲۰- تا ۷۰- ) استفاده میشود ولی در مرحله پیروپلاسمی برای نگهداری محلول از دمای ۴ درجه یخچال و برای لامها از دمای انجماد میتوان استفاده کرد.

سرمهای مورد آزمایش را با ماده bovine lymphocyte lysate رقیق میکنند و با محلول آنتی ژنی در انکوباتور میگذارند و بعد ضد ایمنوگلوبولین متصل گاوی anti-bovine immunoglubolin conjugate افزوده میشود.

الف) تهیه لام یا اسلاید آنتی ژن شیزونت

آنتی ژن مورد استفاده برای schizont IFA test ازتیره سلولی شیزونت لیمفوبلاستوئید Lymphoblastoid گرفته میشود. کشتهای سلولی را که دارای رقت ۲۰۰ میلی لیتر شیزونت در یک لیتر شیزونت های آلوده ( به T. parva ویا T. annulata بوده و حاوی ده میلیون سلول در هر میلی لیتر و حداقل ۹۰% سلولها آلوده میباشند ) باشد را سانتریفیوژ کرده ( بمدت ۲۰ دقیقه در سرعت ۲۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه ) و مایع روئی را دور ریخته و سلولهای ته نشین شده را با ۱۰۰ میلی لیتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دمای ۴ درجه و pH ۷.۲ تا ۷.۴ مخلوط و دوباره سانتریفیوژ میکنیم. این روش شستشو را سه بار تکرار کرده و در آخرین با رسلولهای ته نشین شده را با ۱۰۰ میلی لیتر PBS مخلوط کرده تا غلظت نهائی حدودCELL/ML ۷ ۱۰ درآید.

گسترش نازک از محلول سلولی را روی اسلاید حفره دار ( از جنس تفلن )‌تهیه کرده ویا روی لام معمولی را با استفاده از لاک ناخن تقسیم کنیم . هر گسترش باید دارای ۵۰ تا ۸۰ سلول سالم در هر دید میکروسکوپی Field ‌باشد (‌وقتیکه با بزرگنمایی ۴۰ با روغن Immersion بررسی شود) .بوسیله پی پت ۱۰۰۹۵۶;l آنتی ژنها را با مکش یکدفعه روی لام ریخته که پس از توزیع محلول شیزنت یا پیروپلاسم یک لایه Monolayer در هر کدام باقی می ماند. اینکار را برای هر حفره انجام داده تا مایع تمام شود. بااین روش تقریبا‌می توان ۶۰۰لام با کیفیت خوب که حاوی ۶ هزار سلول در هر نقطه آنتی ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشک کرده ودراستن بمدت ده دقیقه ثابت کرده (‌Fixation)‌ وبطور جداگانه دردستمال کاغذی پیچیده و سپس در کاغذ آلومینیم (‌فویل آلومینیم ‌) ‌وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردمای۲۰- درجه سانتیگرادیا ۷۰ - درجه سانتیگراد نگه می داریم . دردمای ۲۰ درجه سانتیگراد بمدت یکسال قابل استفاده هستند ودردرمای ۷۰ درجه سانتیگراد بمدت طولانی تر (‌دردمای یخچال ۴ درجه سانتیگراد بمدت چهارماه قابل نگهداری هستند).

ب) محلول آنتی ژن شیزونت

ابتدا ۵۰۰ میلی لیتر از محلول T.annalataیا T. parva سلولهای آلوده با غلظت ۱۰ ۶cell/ml سلول سانترفیوژکرده (‌در ۱۵۰ g دور دردقیقه برای ده دقیقه در دمای ۴ درجه )‌ وسلولهای ته نشین شده در۱۰۰سی سیPBS سرد دوبار شستشو می دهیم.

قابلیت زنده بودن سلولها را بوسیله اوزین Eosin یا Trypan blue بررسی میشود (‌که باید بیش از %۹۰‌باشد )‌محلول سلولها باید درمحلول سرم فیریولوژی سرد رقیق شود تا غلظت ۷ ۱۰سلول (/ml Cell) بدست آید دراین حجم ، ‌دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوی ۸۰%‌ استن و ۰.۱ % فرمالین در PBS قطره قطره اضافه کرده (‌در درمای ۲۰ درجه )‌تا درمدت ۲۴ ساعت به تثبیت رسد.

سلولهای ثابت شده را سه بار شستشو داده (‌در سرم فیولوژی سرد شده دردمای ۴ درجه ) و‌در ۲۰۰ دور دردقیقه بمدت ۲۰ دقیقه سانترفیوژ میکنیم. بعد از آخرین شتشو سلولهای ته نشین شده را در سرم فیولوژی رقیق کرده تا غلظت ۱۰۷/ml بدست آید . بمیزان ۵/۰ سی سی سلولهای ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسیم می کنیم .

● تهیه اسلاید حاوی آنتی ژن پیروپلاسم:

مرحله پیرپلاسمی گونه های تیلریا را نمی توان درکشت سلول نگهداری یا تهیه نمایند. زیرا آنتی ژن پیروپلاسمی باید از حیوانات زنده آلوده تهیه شود و عفونتهای تجربی بوسیله تزریق زیر پوستی با اسپروزئیت یا کنه های آلوده باT.parva T.taurotragi ,T.annulata , صورت میگیرد. آلودگی گروه انگلی T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسیله تزریق داخل رگی خون حیوان ناقل به گاو یا گوساله طحال برداشته و یا تماس با کنه آلوده ایجاد می شود. وقتیکه آلودگی پیروپلاسمی بیش از ۵% ‌باشد، صد میلی لیتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبی با PBS مخلوط می کنیم . این مخلوط را سانترفیوژ کرده (‌با۵۰۰دور در دقیقه برای ده دقیقه)‌ و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا کرده و RBC های باقی مانده را بادولیتر PBS رقیق می کنیم.

اقتباس از دستورالعمل OIE (Office International des Epizooties) اکتبر ۲۰۰۱ Chapter ۳.۲.۱۱ .

ترجمه و تنظیم : دکتر محمد سربی و دکتر حمید کشتمند