تکنیک‌های تهیه و تولید کشت آگار

● مقدمه
هوایی که از آن تنفس می‌کنیم مملو از موجودات بسیار ریز است که با باد به حرکت درمی‌آیند. قارچ‌ها، باکتریها، ویروسها و گیاهان برای انتقال گرده‌های خود به مناطق دیگر از باد کمک می‌گیرند. در صورت عدم رعایت نکات بهداشتی، این ذرات می‌توانند چه در تهیه کشت خالص و چه در فرآیند تولید قارچ خوراکی خلل وارد نمایند.
به طور کلی منابع اصلی آلاینده محیط کشت عبارتند از
۱) محیط اطراف
۲) ظروف کشت
۳) ادوات و ابزار کشت
۴) پرورش دهنده و لباس وی
۵) هاگ‌ها یا میسلیوم قارچ خوراکی
قارچ‌ها و تمامی موجودات زنده نسبت به مواد غذایی، رقابت تنگاتنگ و دائمی با یکدیگر دارند. هدف از ایجاد یک محیط استریل، حذف یا کاهش این گونه رقابت و در نهایت فراهم ساختن شرایط مناسب برای تکثیر قارچ خوراکی می‌باشد. اولین مرحله قبل از تهیه کشت خالص، احداث اطاقک تلقیح یا آزمایشگاه استریل است.
● طراحی و احداث آزمایشگاه استریل
علت عمده شکست بیشتر پرورش‌دهندگان قارچ، عدم صرف وقت کافی به منظور احداث آزمایشگاه استریل است. کاری که چندان هم وقت و انرژی نمی‌برد، بلکه فقط یک و نیم روز کافی است تا یک انباری کوچک یا یک آبدارخانه را به یک اطاقک تلقیح مفید تبدیل نمود.
برای شروع تمام قالیچه‌ها، پتوها، پرده‌ها و دیگر مواد پارچه‌ای را که پناهگاه خوبی برای گرد و غبار و هاگ‌های مضر می باشند از محل دور کرده و تمامی دیوارها و سقف را با یک ماده ضد عفونی کننده کاملاً تمیز نمائید. اطاق را با یک رنگ روغنی براق یا اپوکسی بهداشتی رنگ زده تا شستشو‌های بعدی راحت‌تر گردد. پنجره‌ها یا هر منبع ورودی هوا را با یک پوشش پلاستیکی مناسب بپوشانید. محل ورودی اطاق را با پلاستیک یا هر ماده دیگر بصورت یک محفظه انتظار درآورده تا مانع جریان مستقیم هوا بدرون اطاق گردد و طراحی این محفظه باید به گونه‌ای باشد که هنگام ورود به آن؛ درب آزمایشگاه بسته باشد.
تجهیزات ذیل در هر آزمایشگاه ضروری است:
۱) صندلی و میز محکم با سطح کاملاً صاف
۲) چراغ الکلی، چراغ بنسن یا یک شعله معمولی گاز بوتان برای تولید حرارت
۳)بطری اسپری حاوی محلول سفید کننده ۱۰ درصد
۴) تعدادی پتری دیش استریل و لوله آزمایش
۵) تعدادی برچسب ، یک دفتر و خودکار
۶) یک چاقوی آگار و حلقه تلقیح
۷) یک دستگاه اتوکلاو یا زودپز معمولی (بخار تحت فشار)
۸) pH سنج یا کاغذ تورنسل معمولی
۹) الکل ۹۶ درصد و دیگر مواد ضد عفونی همچون وایتکس، فرمالین…
۱۰) قفسه برای ظروف کشت، جالوله‌ای و…
تمامی این اجزاء بایستی درون آزمایشگاه بماند و در صورت خروج یکی از آنها به بیرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمایشگاه باید از تمیز بودن آن، مطمئن شد.
به طور کلی برای طراحی یک آزمایشگاه باید علاوه بر تجهیزات و وسایل گفته شده اصول زیر نیز درنظر گرفته شود.
اطاق تهیه محیط کشت که دارای تجهیزات کامل و قفسه‌های متعدد است (۳۵ درصد مساحت کل)
اطاقک شیشه‌ای استریل (محفظه تلقیح)(۱۵ درصد مساحت کل)
اتاق کشت (۴۰ درصد مساحت کل) الباقی مساحت برای نگهداری وسایل، اتوکلاو، ترازوها، یخچال و انبار میسلیوم و اسپان مادری (حدوداً ۱۰ درصد)
با روش ساده‌ای می‌توان آزمایشگاه یا محیطی نیمه استریل بسته به حجم استفاده و دفعات کاری ایجاد نمود. درصد پاکی لازم برای اطاق استریل تابع مقدار هاگ محیط بیرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاینده‌های هوا تا حد زیادی کاهش یافته، حال آن که در طول تابستان و بهار این مقدار بسیار زیاد می‌باشد. بنابراین لازم است در طی این دو فصل توجه کافی به استریل بودن محیط آزمایشگاه مبذول گردد. نکته مهم دیگر این که، تمامی ظروف و بطری‌های شیشه‌ای آلوده را باید به طریقی از بین برد تا ضریب آلودگی محیط آزمایشگاه به حداقل برسد.بعد از احداث اطاق استریل باید یک سری اصول و نکات بهداشتی را کاملاً رعایت نمود. به این صورت که اطاق استریل را باید با یک محلول سفیدکننده (آب ژاول) کاملاً تمیز نمود؛ کف را طی کشیده و در پایان هوای اطاق را با یک محلول سفید کننده ۱۰ درصد و با استفاده از یک سمپاشی پشتی یا اسپری ضدعفونی نمائیم. حداقل تا ۱۵ دقیقه بعد از محلول پاشی نباید وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقیح و کشت این عملیات باید تکرار شود، چرا که همواره پیشگیری آسانتر و بهتر از درمان است.
پیش از ادامه بحث، ذکر چند نکته ضروری است. استریل نمودن و استریل نگاه داشتن محیط مستلزم توجه زیاد همراه با کمک و یاری مداوم دیگران است. این امر وقت‌گیر بوده و نباید سرسری و مقطعی انجام گیرد. هرگز یک چراغ الکلی یا شعله گاز را درون اطاق یا محفظه تلقیح روشن نگذارید، چرا که در یک محیط بسته اکسیژن هوا به زودی تمام می‌شود.
بعضی از پرورش‌دهندگان، بیش از نیاز لازم بهداشتی با آلودگی مقابله می‌نمایند. بدین ترتیب این افراد آزمایشگاه و در نهایت سلامتی خود را با مصرف وسواسی و افراطی قارچ‌کشها، باکتری‌کشها و ضدعفونی کننده‌های شیمیائی جهش‌زای خطرناک به خطر می‌اندازند. به طور مثال می‌توان به عوارضی همچون تنگی نفس، بی‌حسی‌های شدید همراه با تشنج‌های مداوم که گاه تا چندین روز نیز به درازا می‌انجامد که بر اثر کار طولانی مدت افراد، بلافاصله در اطاق‌هائی که مدت چندانی (کمتر از ۱۵ دقیقه) از سمپاشی آنها بالاخص با سموم فنلی نگذشته اشاره کرد و یا از بین موارد متعدد دیگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولانی (چند سال) و مستقیم پوست (بدون پوشش ایمنی) با اشعه ماورای بنفش (uv) در حین استریل کردن نمونه‌ها داخل محفظه شیشه‌ای درون اطاق تلقیح اشاره نمود.
چنانچه علیرغم تلاش فراوان در جهت استریل نمودن محیط آلودگی باز هم در محیط باقی بماند در آن صورت می‌توان از راه‌کارهای ذیل استفاده نمود.
۱) بخوردادن روغن استریل‌کننده مانند تری‌اتیلن گلایکول با‌گرم‌کن‌فتیله‌ای در‌فضای اطاق که ابری از قطرات بسیار ریز و نسبتاً سنگین در هوا ایجاد شده که ضمن پائین آمدن ذرات آلاینده معلق در هوا را جذب کرده و از بین می‌برند. ذرات این روغن نسبتاً ریز و فرار بوده و هیچ گونه لایه قابل مشاهده‌ای در فضا ایجاد نمی‌نماید. این روش ارزان و آسان می‌باشد.
۲) احداث نوعی محفظه شیشه‌ای کاملاً مسدود و نیمه استریل برای نقل و انتقال و کارهای کشت بافت که می‌توان آنها را از چوب و پنجره‌ای کوچک برای نگاه کردن درون آن ساخت که در یک طرف آن دو سوراخ لاستیکی مخصوص تعبیه می‌نمایند تا هنگام کار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه کرده و در صورت عدم استفاده، ورودی سوراخ‌ها با لفافه‌ای پوشیده می‌شود. مزیت عمده این محفظه ارزان، بودن استریل کردن آسان محیط داخل آن و عدم جریان مستقیم هوا به درون آن در ضمن کار می‌باشد.
۳) استفاده از صافی‌های بسیار ریز که قطر چشمه‌های آن ۳/۰-۱/۰ میکرون بوده و از قطر هاگهای مضر بعضی قارچ‌ها و حتی از باکتری‌ها نیز کوچکتر است. از این صافی‌ها در سامانه‌های مخصوصی بنام هود تهویه ملایم استفاده می‌نمایند. در برخی از آزمایشگاه‌های پیشرفته تمام استریل، درون دیوارها یا سقف نیز از این نوع صافی‌ها استفاده شده و هوای ورودی اطاق با عبور از میان آنها تصفیه می‌شود.
برای کسب اطلاعات بیشتر به ضمیمه چهارم مراجعه شود
آلودگی، ممکن است در یک محل کم و در جای دیگر زیاد باشد و یا در یک مرحله از پرورش طغیان نماید یا این که علی‌رغم چند سال فعالیت، اثری از آن دیده نشود. از طرفی باید توجه داشت که نوع آلودگی، در مراحل و مکان‌های مختلف یکسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به یک سری عوامل مختلف داخلی یا محیطی متفاوت است که با اعمال یک سری تمهیدات و اصول بهداشتی تا حدی می‌توان آن را کنترل نمود.
● میزان هاگ آلاینده درون آزمایشگاه
▪ آماده کردن محیط کشت
پس از تکمیل آزمایشگاه نوبت به تهیه محیط کشت مغذی آگار می‌رسد. آگار، محصولی است که از نوعی جلبک دریایی بدست آمده و برای سفت کردن محیط کشت بکار می‌رود و از نظر ظاهری بسیار شبیه ژلاتین است اما از نظر کارکرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمینه تولید محیط کشت آگار غنی شده که مناسب قارچ‌های خوراکی باشد، فرمول‌های متعددی وجود دارد که از این میان می‌توان به فرمول‌های استاندارد PDA وMEA همراه با مکمل خمیرمایه اشاره نمود. در بسیاری از مجلات قارچ شناسی، فهرستی از انواع محیط‌های کشت آگار حاوی پپتن و نئوپپتن (دو منبع سرشار از پروتئین مورد نیاز میسلیوم) ارائه شده است. محیط کشتی که مؤلفان توصیه می‌نمایند، مخلوطی از دانه‌های جوشانده شده گندم یا چاودار غنی شده با شیره مالت است. برای افزایش رشد می‌توان به محیط کشت زایلوز و ۱- آرابینوز (از قندهای پنج کربنه پنتوزی متبلور) اضافه کرد. از جمله مواد لازم دیگر برای محیط کشت می‌توان کلسیم، بیوتین، تیامین، اسیدهای آمینه اسپاراژین، آلانین و گلایزین را نام برد.
آنچه در ادامه‌می‌بینید سه نوع فرمول مغذی آگار است که هر کدام از آنها برای رشد میسلیومهای انواع مختلف قارچ خوراکی همچون دکمه‌ای، صدفی، شی‌تاکه، استروفاریا، چینی، پانالوس و سیلوسب استفاده می‌شود که از بین آنها؛ ۲ محیط PDY و MPG مورد توجه مؤلفان این کتاب می‌باشند. توصیه می‌شود برای افزایش رشد میسلیوم‌ها به هر محیط، مقداری پودر چاودار و یا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر یک از فرمول‌های زیر ترکیبات آن را بصورت خشک با هم مخلوط کرده، درون یک فلاسک ریخته و درنهایت با افزودن آب، حجم مخلوط را به یک لیتر برسانید.
الف) آگار PDY (مخمر دکستروز سیب‌زمینی)
ـ عصاره صاف شده ۳۰۰ گرم خلال سیب‌زمینی که در یک لیتر آب تا یک ساعت جوشیده باشد.
ـ ۱۰ گرم قند (گلوکز راست گرد) (قند دکستروز)
ـ ۲ گرم مخمر (اختیاری)
- ۲۰ گرم آگار
ب) آگار MPG (مخلوط بذرـ پپتین ـ مالت)
ـ ۲۰ گرم مالت عسلی رنگ
ـ ۵ گرم پودر بذر چاودار
ـ ۵ گرم پپتین یا نئوپپتن
ـ ۲ گرم مخمر (اختیاری)
ـ ۲۰ گرم آگار
ج) آگار MEA (آگار عصاره مالت)
ـ ۲۰ گرم مالت عسلی رنگ
ـ ۲ گرم مخمر
ـ ۲۰ گرم آگار
● در تهیه محیط کشت، رعایت نکات زیر ضروری است
۱) pH محیط کشت: گونه‌های متفاوت قارچ برای رشد و نمو در محیط کشت، pH خاص خود را می‌طلبند. بطوری که pH مطلوب برای گونه‌های سیلوب ۷-۶ می‌باشد؛ در حالی که این مقدار برای نوع دکمه‌ای ۷-۵/۶ می‌باشد. اکثر گونه‌ها، نسبتاً مقاوم بوده و بخوبی در دامنه ۵/۷ –۵/۵ رشد می‌نمایند. pH کمتر از ۵/۴ و بالاتر از ۷ باعث توقف رشد و نمو (هاگ‌‌‌‌‌ها و میسلیومها) می‌گردد و چنانچه pH محیط خیلی پائین باشد. محیط کشت رقیق می‌شود و باید محیط تازه با pH مطلوب آماده شود. pH ، بعد از اتوکلاو کردن تا ۴/۰ واحد کاهش می‌یابد.
چنانچه در حین تهیه محیط کشت، pH خیلی پائین یا بالا رود، می‌توان بترتیب آن را با Naoh یا Hcl (۱ تا ۱/۰ مولار) رقیق، تعدیل کرده سپس محیط کشت را کاملاً هم زده و سپس pH آن را با یک pH سنج یا کاغذ تورنسل معمولی می‌سنجیم ( pH یک مول Hcl ، صفر؛ یک مول Naoh =۱۲ و یک مول آب مقطر= ۷ است).
۲)ضدعفونی محیط کشت: این کار معمولاً به دو روش صورت می‌گیرد.
الف) با مواد شیمیائی: مانند الکل ۷۰درصد؛ هیپوکلریت سدیم (وایتکس) ۱درصد و بالاخص آنتی‌بیوتیکها. در هر صورت ساده‌ترین راه، استفاده از مواد گیاهی غیر آلوده است. جهت کنترل باکتریها در محیط کشت، ۱/۰ گرم از محلول سولفات جنتامایسین ۸۰-۶۰درصد را قبل از عمل اتوکلاو کردن باید به هر لیتر از این محیط‌ها اضافه نمود. همچنین می‌توان از نوع دیگر آنتی‌بیوتیک بنام استرپتومایسین بعد از استریل کردن محیط کشت استفاده کرد. در مجموع باید از آنتی‌بیوتیکها بصورت موقتی و به مقدار بسیار اندک بهره جست چون غلظت بالای آنها، مانع رشد و نمو بعضی گونه‌ها و از طرف دیگر ایجاد مقاومت در باکتریها می‌شود.
ب) با بخار: بعد از اختلاط کامل ترکیبات محیط کشت و در صورت باقی ماندن اثرات باکتری بعد از ضدعفونیِ شیمیائی (آنتی‌بیوتیکها) می‌توان برای رفع هر گونه آلودگی با بخار تحت فشار، محیط کشت را استریل و یا به اصطلاح اتوکلاو نمود. استریل کردن صحیح، بستگی به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استریل دارد. در شرایط عادی می‌توان محیط کشت آماده را داخل ارلن پیرکس (به علت دهانه تنگ آن میزان تهویه، خشک شدن و ضریب آلودگی کاهش می‌یابد) ریخته درب آن را با یک فویل آلومینیومی پوشاند. دقت کنید که حجم آگار درون ارلن نباید از تا حجم کل ظرف بیشتر شود.
ظرف کشت را داخل اتوکلاو یا زودپز معمولی قرار داده و ته زود‌پز را یک سانتی‌متر آب مقطر بریزید تا بخار لازم تأمین شود. طبق دستورالعمل شرکت سازنده، درب زودپز را کاملاً بسته آن را حرارت دهید تا بخار فراوان تولید نماید. قبل از بستن سوپاپ اطمینان بخار، بگذارید تا بخار آن به مدت ۴ تا ۵ دقیقه خارج شود. به آرامی فشار را به ۱۵ پوند رسانده و ۳۰ دقیقه در همین فشار نگهدارید. توجه کنید دمای ظرف از ۱۲۱ درجه سانتی گراد فراتر نرود، چه در غیر این صورت قند موجود در محیط کشت، سوخته و به اصطلاح کارامل می‌شود که در نتیجه آن؛ رشد میسلیوم متوقف شده، یکسری جهش‌های ناخواسته ژنتیکی پدیدار می‌شود. از طرفی اتوکلاو کردن بیش از ۳۰ دقیقه باعث ته‌نشین شدن املاح مفید (بخصوص k+ ) و تجزیه آگار می‌شود. هم چنین باید ظروف خالی شیشه‌ای و کاغذها را بطور جداگانه به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۱۳۰ سانتی‌گراد (بصورت خشک) استریل نمود.
نکته حائز اهمیت دیگر در مورد اتوکلاو کردن، این که زمان لازم برای این عمل بسته به ارتفاع از سطح دریا، متفاوت است. طبق قانون بویل ـ ماریوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقیمی با یکدیگر دارند. فشار هوا را معمولاً نسبت به سطح استاندارد دریا محاسبه ‌نموده و هر چه از سطح دریا بالاتر می‌رویم فشار هوا کمتر می‌شود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دریا، باید فشار اتوکلاو یا زودپز را افزایش دهیم تا خللی در عمل استریلیزاسیون وارد نشود. ذیلاً نسبت‌های بین پارامترهای دما، فشار هوا، و تغییرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذیل می‌بینید. بعنوان مثال در ارتفاع حدوداً ۱۵۰۰ متری از سطح دریا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دریا تقریباً ۵/۴ -۵ درجه سانتی‌گراد کاهش می‌یابد (C&#۷۳۰;۹۵) و از طرفی در این ارتفاع؛ فشار هوا ۵ پوند یا تقریباً ۴/۰ اتمسفر نسبت به سطح دریا افزایش می‌یابد (۴/۱ اتمسفر) در نتیجه با توجه با این که نباید دمای داخل اتوکلاو را (به سبب بروز تغییرات شیمیائی مواد داخل آن) افزایش دهیم، بناچار مجبوریم، فشار را به میزان ۴/۰ آتمسفر (۵ پوند) بالا ببریم تا جبران ۵ اختلاف دما را در این ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوکلاو بنماید.توجه کنید استریلیزاسیون در فشار ۰۵/۱ kg/cm۲ به مدت یک ساعت دارای نتایج مشابهی با استریلیزاسیون در فشار kg/cm۲۲ به مدت ۳۰ دقیقه (یعنی دوبرابر کردن فشار و نصف کردن مدت زمان) دارد؛ منتها مسأله مهم در این جا این است که اکثر زودپزها تحمل این فشار را ندارند که باید حتماً قبل از استفاده به برچسب کنترل کیفی روی هر زودپز توجه شود.
بعد از اتمام استریل کردن؛ زودپز را در آزمایشگاه یا یک اطاق نیمه استریل قرار داده، اجازه دهید تا قبل از باز کردن درب آن، فشار به یک پوند (۰۷/۰kg/cm۲) کاهش یابد. سپس درب آن را باز نمائید و اقدام به ریختن آگار در پتری دیش‌ها نمائید. باید دانست با هر لیتر از محلول آگار بدست آمده می‌توان ۳۰ پتری دیش ۱۵×۱۰۰ میلی‌متر را پر نمود. چنانچه با محدودیت فضای میزکار مواجه هستید، می‌توانید پتری دیش‌ها را پس از پر نمودن یک به یک روی هم بگذارید اما در‌غیر این صورت می‌توانید هر یک از پتری دیش‌ها را در کنار هم قرار دهید و دامنه کار خود را توسعه دهید
پیش از پر نمودن پتری دیش‌ها، محلول کشت را به شدت تکان دهید تا محتویات آن خوب پخش شده مخلوطی همگن بدست آید. سپس بگذارید تا آگار خنک شده و یکنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتری دیش‌ها نمائید تا بدین وسیله از تعریق جدار داخلی ظروف که از ریختن محلول آگار گرم ناشی می‌شود، جلوگیری شود.
حال، این محلول آماده کشت هاگ یا بافت زنده می‌باشد که در ادامه روش آنرا خواهیم دید.
● کشت هاگ
کشت خالص به منظور تهیه اسپان مورد نیاز برای تکثیر قارچ خوراکی را به دو روش می‌توان تهیه نمود. کشت هاگ، که به نوعی می‌توان آن را تکثیر جنسی نامید و دارای تفریق صفات و تنوع بالای نتاج حاصله از نظر کیفیت و کمیت محصول می‌باشد. از این روش بیشتر برای تهیه بذر قارچ استفاده می‌شود. روش دوم کشت بافت زنده یا به اصطلاح تکثیر غیرجنسی و یا کلونینگ می‌باشد. این روش به علت شباهت بالای نتاج تولیدی با والدین؛ بیشتر در تکثیر قارچ‌هائی که از نظر کیفیت و کمیت محصول در حد مطلوبی هستند استفاده می‌شود.
پرورش دهندگان قارچ، کشت هاگ را بدلیل راحتی اجرا و ماندگاری بالای هاگ‌ها حتی تا ماهها بعد از تجزیه کلاهکها ترجیح می‌دهند. اما ماندگاری کلاهکها یا بافت زنده بسیار کم است (۱ تا ۲ روز) و باید بلافاصله بعد از چیدن بافت، اقدام به کشت نمود.
● گرفتن نقش هاگ
مرحله اول در کشت هاگ؛ جمع‌آوری مقداری هاگ (نقش اسپور) از قارچ‌های سالم و مناسب می‌باشد. بدین منظور کلاهک سالم، تازه و کاملاً تمیزی را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روی یک کاغذ سفید یا سطح شیشه‌ای تمیز (اسلاید میکروسکوپ) یک تا دو ساعت می‌گذاریم. چنان‌چه کلاهک موردنظر خشک باشد، جهت رهاسازی آسانتر هاگ یکی دو قطره آب مقطر به آن زده و برای جلوگیری از کاهش تبخیر و جریان هوای مستقیم، یک بشر بر روی آن می‌گذاریم. پس از چند ساعت که هاگ‌ها، کاملاً رها شد و نقش تیغه‌ها روی کاغذ افتاد؛ کاغذ هاگ‌ها را بریده از وسط تا می‌زنیم و دریک ظرف کاملاً در بسته گذاشته وروی آن را بر چسبی حاوی زمان جمع‌آوری؛ گونه قارچ و شماره جمع‌آوری می‌زنیم. در صورت جمع‌آوری هاگ‌ها روی لامل میکروسکوپ، کافیست هاگ‌ها را ما بین دو لامل قرار داده دور تا دور لبه این دو لامل را با نوار چسب بچسبانیم تا از نفوذ هاگ‌های آلاینده، ایمن شود. در صورتی که در جمع‌آوری و نگهداری هاگ‌ها دقت کافی نشود، محیط کشت هاگ آلوده شده و امکان به دست آوردن یک کشت خالص کاهش می‌یابد.

منبع: پارس بیولوژی

منبع : راسخون