تعیین مرحله ی رسیدگی جنسی ماهیان خاویاری ماده برای تکثیر مصنوعی: شاخص قطبی شدن تخمک یا PI

● مقدمه
ماهیان خاویاری معمولاً بطور طبیعی در شرایط اسارت تخم ریزی نمی کنند و می بایست با استفاده از هورمون های برون زا وادار به تخم ریزی شوند. زمان بروز رفتار مهاجرت تولیدمثلی (مانند، مهاجرت از اقیانوس به قسمت علیای رودخانه)، حضور ماهی رسیده در مکان های تولیدمثلی، و ظاهر بیرونی مولدین ماده بطور سنتی برای تعیین رسیدگی و مشخص نمودن زمان ویژه تولیدمثل استفاده می شود. اگرچه، تشخیص ماهیان خاویاری آماده ی تولیدمثل (رسیده) بر مبنای رفتار تولیدمثلی و خصوصیات جنسی ظاهریِ محدود، می تواند، به ویژه در ذخایر اهلی و پرورشی که تحت شرایط پرورشی رشد می یابند، گمراه کننده باشد، چون ماهیان پرورشی در شرایط طبیعی که سبب رسیدگی جنسی شده و به عنوان علائم تولیدمثلی بکار می روند، قرار ندارند. انتخاب ماهی مولد ماده برای تخم ریزی بدون تشخیص مناسب مرحله رسیدگی تخمک اغلب موجب تخمک گذاری (اوولاسیون) ناقص یا انجام نشدن تخمک گذاری می شود، یا تخمک گذاری صورت می پذیرد اما تخمک های با لقاح پایین یا جنین های با زنده مانی نازل بدست می آید. عوامل مختلفی بر انجام موفق تخمک گذاری و تخم ریزی در ماهیان خاویاری پرورشی، اعم از دما و رژیم نوری، روش های پرورشی، جا به جایی و حمل و نقل، دستورالعمل تخم ریزی القایی، و ژنتیک ذخایر مولدین، موثرند. اگرچه، آزمون های نسبتاً ساده ی میدانی و آزمایشگاهی برای تعیین پاسخ قابل پیش بینی تخمک گذاری در ماهیان خاویاری ماده قابل استفاده می باشند. ساده ترین و قابل اتکاترین شاخص که نشاندهنده ی آمادگی ماهی ماده برای تخم ریزی است، اندازه ی تخمک و موقعیت هسته ی تخمک در سیتوپلاسم، که شاخص قطبی شدن تخمک یا PI نامیده می شود، می باشد.
● مبانی
بارزترین صفت قابل مشاهده در فرایند تشکیل تخمک (اووسیت) (اووژنز) رشد زیاد تخمک، به خاطر ذخیره مداوم زرده و دیگر مواد مغذی از خون در داخل تخمک، می باشد. بعد از کامل شدن ذخیره زرده، تخمک به حداکثر اندازه ی خود می رسد، که شاخصی خوب برای تعیین آمادگی ماهی برای تخم ریزی می باشد. نشان داده شده که اندازه ی تخمک یک صفت ارثی در ماهیان می باشد، و همبستگی مثبت بین اندازه ی تخمک و رشد وجود دارد؛ اگرچه این اندازه تحت تاثیر اندازه ی بدن و سن ماهی مولد ماده، تامین و کیفیت مواد غذایی، و دیگر عوامل محیطی می باشد.
ماهیان خاویاری یک رابطه ی تکاملی واضحی بین اندازه ی تخمک و گونه ها از خود نشان می دهند، هر گونه، در جمعیت طبیعی و پرورشی، دارای اندازه ی تخمک مختص به خود می باشد. برای مثال، ماهی خاویاری سبز (Acipernser medirostris) تخم های خیلی بزرگ (قطر ۴-۷/۴ میلی متر) در مقایسه با قطر ۲-۸/۲ میلی متر استرلت (A. ruthenus)، یکی از ماهیان خاویاری با کوچک ترین تخمک، دارا می باشد. اندازه ی تیپیکال برای گونه های متداول در صید ماهیان خاویاری، ۶/۳-۳/۴ میلی متر در بلوگا (Huso huso)، ۲/۳-۸/۳ میلی متر در تاس ماهی روسی (A. guldenstaedti)، و ۷/۲-۲/۳ میلی متر در سوروگا (A. stellatus) است. اندازه ی تخمک در ماهیان خاویاری پرورشی مرسوم، ۲/۳-۴ میلی متر در ماهی خاویاری سفید (A. transmontanus)، و ۴/۲-۳ میلی متر در ماهی خاویاری سیبری (A. baerii) گزارش شده است.
در تخمدان، سلول های فولیکولی که ذخیره شدن زرده در تخمک را تسهیل می کنند، تخمک را در بر می گیرند. بین غشاء تخمک و سلول های فولیکولی، کوریون تخمک، یک پوشش محکم با ضخامت متغیر، که از جنین در حال رشد در طول انکوباسیون حفاظت می کند، وجود دارد. با افزایش اندازه، در این مرحله تخمک به رسیدگی می رسد. در طول هر چرخه ی تخمدانی، تخمک ها برای مدت طولانی در مرحله ی توقف تقسیم سلولی و هسته ایی باقی می مانند (یعنی، تقسیم میوز متوقف می شود)، تا زمانیکه زرده در داخل تخمک ذخیره شده و تخمک ها به اندازه ی مشخص خود برسند، اطلاعات ژنتیکی نیز در طول این زمان نسخه برداری می شوند. برای اولین چرخه تخمدانی، در ماهیان خاویاری ماده تقسیم میوزی تخمک برای چندین سال متوقف می ماند (۲-۶ سال) تا زمانیکه ماهیان ماده به بلوغ جنسی برسند. بعد از این، هر چرخه تخمدانی ممکن است از چند ماه تا چند سال بطول انجامد.
موفقیت در امر تخم ریزی ابتداً تحت تاثیر رسیدگی تخمک می باشد. زمانیکه تخمک ها به اندازه ی خاصی با توجه به نوع گونه رسید، تخمک وارد رسیدگی نهایی شده و تقسیم میوزی از سر گرفته می شود. در همین زمان هسته (ژرمینال وزیکول) به سمت کناره های تخمک مهاجرت می کند؛ در این مکان غشاء هسته می شکند (GVBD). در این زمان اگر تخمک ها در فاصله های زمانی مختلف نمونه برداری شوند، موقعیت ژرمینال وزیکول بطور واضح از مرکز تخمک به کناره ها، نزدیک قطب حیوانی، تغییر مکان می دهد. تخمک بیضوی شکل دارای قطب حیوانی و رویشی است. ناحیه قطب حیوانی (AP) حاوی زرده کم متمایل به رنگ سفید بوده (F-yolk)، در صورتیکه قطب رویشی (VP) از صفحات زرده وسیع تر و متمایل به رنگ زرد (C-yolk) تشکیل شده است. زمانیکه هسته به نزدیکی کناره غشاء پلاسمایی تخمک رسید؛ درست زیر کوریون، ماهی ماده رسیده شده و آماده ی تخم ریزی می گردد. در درجه اول بسته به دمای آب، مهاجرت هسته به کناره تخمک ممکن است از چند روز تا چند هفته، و حتی ماه ها، به طول انجامد.
به منظور بدست آمدن رشد حداکثری، بیشتر ماهیان خاویاری پرورشی در آب با دمای ۴-۶ درجه سانتی گراد بالاتر از دمای اپتیمم تخم ریزی، پرورش داده می شوند. دمای مناسب آب برای تخم ریزی ماهیان خاویاری بین ۱۴ تا ۱۸ درجه سانتی گراد، بسته به نوع گونه گزارش شده است. ماه ها قبل از تخم ریزی، مولدین ماده (و نر) انتخاب شده باید در دمای خنک تر (ترجیحاً ۴-۵ درجه سانتی گراد پایین تر از دمای تخم ریزی) نگهداری شوند. قبل از تخم ریزی دمای آب به کندی تا دمای اپتیمم تخم ریزی افزایش می یابد تا آنچه که در آب در حال گرم شدن رودخانه در بهار در زمان تخم ریزی طبیعی ماهیان خاویاری اتفاق می افتد، شبیه سازی شود.
● موادها
▪ برای دستکاری و حمل و نقل: تور لوله ایی، برانکارد و نیمکت، منبع آب شیرین، برچسب (tag) یا سیستم ID.
▪ برای بافت برداری ( بیوپسی) غدد جنسی: دستکش جراحی، کاتتر یا لوله قابل انعطاف حداقل با قطر داخلی ۴ میلی متر یا تراکر (Trocar) تغییر یافته، اسکالپل دسته شماره ۳، چاقوی جراحی با تیغ شماره ۱۰ یا ۱۵، فورسپس بافتی آدسون- براون با ۷×۷ دندانه، سوزن نگهدارنده ی اُلسن- هگر، بخیه های قابل جذب، محلول ۱ درصد ید، پاک کننده ی استریل، الکل یا ید برای پاک کردن و استریل وسایل در فاصله ی بین نمونه گیری، و ظروف کوچک نوک دار برای تیغه ها و سوزن بخیه ی مستعمل.
▪ برای نمونه گیری تخمک: ویال های ۲۵ میلی لیتری یا لوله سانتریفوژ یا فلاسک کشت بافت، محیط کشت (مانند محلول رینگر یا لی بوویتز ، در بطری پلاستیکی یک لیتری)، دو سرد کننده ی حاوی ژل یا یخ مرطوب، برای نگهداری محیط کشت و برای انتقال ظروف حاوی تخمک در دمای ۱۴-۱۸ درجه سانتی گراد، ترازو و لوازم توزین مواد شیمیایی (NaCl، ۵/۶ گرم، NaHCO۳، ۲ گرم، CaCl۲، ۳۰۰ گرم، و KCl، ۲۵۰ میلی گرم) برای ساخت محلول رینگر که به یک لیتر آب مقطر یا آب یون برداری شده (دیونیزه) اضافه می شود.
▪ برای تعیین شاخص PI: پیپیت های پلاستیکی قابل جا به جایی یکبار مصرف (برای جا به جایی و انتقال تخمک ها)، بشرهای ۲۰ میلی لیتر، سنگ جوش (Boiling stone)، فویل آلمینیوم، صفحه ی فلزی داغ، دستکش بلند اون، ویال های پلاستیکی ۲۵ میلی لیتری، ثابت کننده ی فرمالین ۱۰ درصد (۹ قسمت آب:۱ قسمت فرمالدئید)، وسایلی برای جا به جایی و برش تخمک ها: فورسپس نازک ادسون- براون، تیغ ریش تراشی دو لبه، سطح برش (کف پتری دیش)، سینی یا ظرف یخ، ذره بین.
▪ مواد متفرقه: کاغذ یا دفترچه ثبت اطلاعات (ترجیحاً ضد آب)، مداد و خودکار، ظرف آشغال، جعبه ابزار یا ظروف مشابه برای نگهداری وسایل جراحی، بخیه و غیره، ظرف کوچک برای نگهداری ابزار جراحی در مواد ضدعفونی کننده، دستمال کاغذی یا حوله، میز کوچک برای قرار دادن ابزار جراحی، بخیه، و دیگر مواد نمونه گیری.
● فرایند بافت برداری
ابتدا از ماهیان ماده تقریباً یک ماه قبل از اولین تخم ریزیِ پیش بینی شده و سپس دو یا سه زمان دیگر نمونه گیری انجام می گیرد، چون هر مولد ماده در زمان های مختلف رسیده و تخم ریزی می کنند. فصل تخم ریزی نوعاً در حدود سه ماه به طول می انجامد اما اگر ماهیان ماده در دمای خنک تر (۶-۷ درجه سانتی گراد پایین تر از دمای تخم ریزی) نگهداری شوند، می تواند بیشتر طول بکشد. ماهیان ماده باید بطور انفرادی با استفاده از یک تور لوله ایی صید و سپس به پشت در برانکارد قرار داده شود. بلافاصله بعد از قرار دادن ماهیان ماده در برانکارد، به منظور آب رساندن به آبشش ها، آب تازه و اکسیژن دار به آرامی به دهان ماهی رسانده می شود. چون کل عمل بیوپسی تنها ۲-۳ دقیقه وقت می گیرد و ماهیان رسیده درشت تمایل به آرام ماندن دارند در صورت استفاده از آب تازه، بیهوشی نیاز نیست. همچنین گرسنه نگه داشتن ماهی قبل از این عمل ضرورتی ندارد.
برای بدست آوردن نمونه تخمک، یک شکاف کوچک (۶-۸ میلی متر) تقریباً ۳-۵ صفحه ی استخوانی (اسکات) جلوتر از باله شکمی و ۵/۲-۳ سانتی متر از خط میانی با استفاده از یک اسکالپل ایجاد می شود. مکان ایده ال برای ایجاد شکاف از پهلو به خط میانی می باشد، چون شکاف در بافت ماهیچه ایی عروقی ایجاد می شود در نتیجه فرایند بهبود و درمان تسریع می شود. شکاف ایجاد شده باید به اندازه ایی باشد که یک لوله انعطاف پذیر مانند کانولا یا کاتتر وارد آن شود. تراکر سفت تغییر یافته، برای ورود پوست به حفره ی بدن، به عنوان روش جایگزین نمونه گیری از تخمک قابل استفاده است. نزدیک به نوک تراکر یک شکاف طویل و عمیق برای استحصال تعدادی تخمک در یک زمان، ایجاد می شود. شکاف شکمی با بخیه ی مصنوعی قابل جذب، با استفاده از بخیه فاصله دار یا بخیه صلیبی، بسته می شود. باید توجه کرد که پاک کردن بیش از حد محل جراحی با مواد ضدعفونی کننده توصیه نمی شود چون برخی از محلول های ضدعفونی کننده ممکن است به پوست ماهی آسیب رسانده و پاک کردن شدید محل، سبب برداشته شدن موکوس که خاصیت ضد میکروبی دارد، خواهد شد. اگر این کار ضرورتی داشت، پاک کردن ملایم موکوس ها از محل جراحی با یک لایه گاز پانسمان استریل و محلول ید ۱ درصد انجام می شود.
تقریباً ۲۰-۳۰ تخمک از هر ماهی ماده نمونه برداری و در ویال پلاستیکی ۲۵ میلی لیتری حاوی محلول تغییر یافته ی رینگر قرار داده می شوند. ویال ها برای اینکار مناسب هستند چون می توان با سرپوش گذاشتن بر روی آن از پرتاب شدن آنها به بیرون در هنگام حمل و نقل جلوگیری نمود. برای حذف هرگونه زرده و بافت تخم های شکسته، خون و بافت چربی، تخمک ها ۲-۳ بار با محلول تازه رینگر شستشو داده می شوند. بعد از شستشو، محلول رینگر تازه به مقدارکافی برای پوشاندن کامل تخمک ها اضافه می شود. تخمک ها را با قرار دادن در داخل یخدان، حاوی یخ مرطوب یا یخ ژل، خنک نگه دارید (۱۴-۱۸ درجه سانتی گراد)، اما مستقیماً روی یخ قرار ندهید. با استفاده از یک قفسه ی شناور یا وسایلی از این قبیل تخمک ها را در حدود ۳-۶ سانتی متر بالاتر از یخ نگهدارید، و آنها را به آزمایشگاه یا مکان عمل آوری که بعد از آن انجام می گیرد، انتقال دهید.
● تعیین شاخص قطبی شدن تخمک (PI)
در آزمایشگاه، تخمک ها در بشرهای شیشه ایی ۲۰ میلی لیتری قرار داده می شوند و با شماره ی مشخص کننده ی هر مولد، برچسب دار می گردند. محلول ذخیره (استوک) رینگر، به حجم کل ۱۵-۲۰ میلی لیتر، به هر بشر اضافه و تخمک ها به آرامی برای ۵ دقیقه جوشانده می شوند. یک تکه از سنگریزه مرمر (یا سنگ جوش) باید به هر بشر اضافه و تمام بشرها با یک لایه فوم آلمینیومی پوشانده شوند، چون در حین جوش خوردن گاهی تخمک ها از داخل آن به بیرون پرتاب می شوند. بعد از جوشاندن، تخمک ها از طریق قرار دادن مستقیم بشرها روی خرده های یخ برای ۱۵-۳۰ دقیقه سرد می شوند. در این زمان تخمک ها را می توان برش داد و مورد ارزیابی قرار داد. ذخیره سازی تخمک ها داخل فرمالین بافر ۱۰ درصد به مدت یک شب برش را خیلی آسان تر می کند، چون برخی از ماهیان مولد خیلی رسیده، حتی بعد از سرد شدن دارای تخمک های نسبتاً نرمی هستند. این تخمک ها بعد از ذخیره سازی داخل فرمالین بافر محکم تر و[ برش آنها] آسان تر می شود.
تخمک ها از محور طولی (محور قطب حیوانی –قطب رویشی) که معمولاً از طریق شکل بیضوی تخمک های تازه جمع آوری شده قابل تشخیص است، برش داده می شوند. اگرچه، جوش دادن، سرد و فیکس کردن این تخمک ها باعث کروی تر شدن آنها می گردد. خوشبختانه، در بیشتر موارد قطب حیوانی از طریق نوع رنگ (حلقه ها و/ یا نقاط سفید در اندازه های مختلف) قابل تشخیص است. هر تخمک با فورسپس نگه داشته شده و با یک تیغ ریش تراشی به دو نیم تقسیم می گردد. دو نیمه به سمت بالا چرخانده شود، در صورت برش درست و دقیق، دو نیمه باید قرینه ی هم باشند. وجود هسته (وزیکول ژرمینال) از طریق تاباندن نور (مانند، میکروسکوپ تشریحی با روشن کننده ی چشمی – فیبری) روی سطح هر نیمه مشاهده می شود. عامل مهم در تعیین PI، برش درست تخمک ها از محور قطب حیوانی - قطب رویشی است. بدین منظور نیاز است که تخمک ها به شیوه ایی به دو نیم تقسیم شوند که دو نیمه برابر، با اندازه ی برابر هسته در هر دو نیمه ایجاد شود. اگر زاویه برش شما نادرست باشد و / یا عدم برش محور قطب حیوانی- رویشی، ارزیابی شاخص PI دقیق نخواهد بود.
برای محاسبه ی شاخص PI، ابتدا قطر طولی، در امتداد محور قطب حیوانی- رویشی، اندازه گیری می شود. اندازه گیری دیگر تعیین فاصله ی کناره ی بیرونی هسته تا غشاء تخمک یا زیر کوریون تخمک (لایه سیاه رنگ نازک) می باشد. شاخص PI از طریق تقسیم فاصله هسته تا کناره تخمک بر قطر تخمک محاسبه می شود. مولدین ماده با PI کمتر از ۱۰/۰ را برای القاء تخم ریزی انتخاب نمایید، اما از این بهتر انتخاب مولدینی با شاخص قطبی شدن ۰۶/۰ – ۰۸/۰ می باشد.
برای اندازه گیری فواصل ابزارهای مختلفی از میکروسکوپ تشریحی با میکرومتر عدسی چشمی، استروسکوپ دیجیتالی و سیستم عکس کامپیوتری وجود دارد. اسکوپ (Scope) تشریحی درشتنما به دلیل قابلیت افزایش تدریجی بزرگنمایی در این مورد تقدم دارد بطوریکه کل تخمک را می توان در بزرگ ترین بزرگ نمایی ممکن مشاهده نمود. میکروسکوپ تشریحی با تنظیم بزرگ نمایی (مانند ۵×، ۱۰×، ۲۰×، ۴۰×) نیز برای این منظور قابل استفاده است اما گاهی تخمک های ماهی خاویاری برای اندازه گیری دقیق در بزرگنمایی کم، خیلی کوچک است و در بزرگنمایی بالا، خیلی بزرگ است. میکروسکوپ تشریحی سه بعدی با دوربین ویدیویی متصل به آن و صفحه تلویزیونی / ویدیویی برای دیدن تخمک های برش داده شده قابل استفاده است، و با میله ی نمایش داده شده روی صفحه نمایش، می توان فواصل مورد نیاز برای تعیین شاخص PI را اندازه گیری نمود. از سیستم مشابه ایی برای دوربین دیجتال یا میکروسکوپ کامپیوتری متصل به یک لپ تاپ، می توان برای اندازه گیری، تصویر تخمک بطور مستقیم از روی صفحه کامپیوتر یا بوسیله ی یک اندازه گیری کننده یا نرم افزار تصویری (مانند سِل پروفیلر) استفاده نمود است. هر ابزاری که استفاده شود، تخمک ها در بزرگنمایی دیده شده به خاطر سپرده می شود، تا اندازه ایی که، می توانید به قدری ورزیده شوید که تنها با دیدن، شاخص PI را تخمین بزنید، مهارتی که به ویژه در میدان کار مفید است.

فرانک ای. چاپمن و ژوئل پی. ون ایننام
مترجم: سید مرتضی ابراهیم زاده-کارشناس ارشد شیلات
([e-mail]
www.bioloyoffish.blogfa.com)
منبع
Chapman, F. A., Van Eenennaam, J. P., Sturgeon Aquaculture - Specialized Techniques: Determining the Stage of Sexual Maturity in Female Sturgeon for Artificial Spawning: The Egg Polarization Index or PI, Fisheries and Aquatic Sciences Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. Original publication date December ۲۰۰۷