روش‌های آزمون آزمایشگاهی

تکنيک‌هاى تجربه‌اى متعددى ــ‌به تنهائى يا همراه باهم‌ــ براى يافتن داروها در ادرار به‌کار مى‌روند. در کل روش‌هاى تست داروئى به دو دسته تقسيم مى‌شوند: غربال‌گرى و اثباتي. حجم بيشترى که در شيشهٔ A ريخته مى‌شود، امکان غربالگرى در سطح وسيع را فراهم مى‌آورد که در صورت لزوم و پيش از گزارش، آزمايش‌هاى ديگرى هم بر روى آن انجام خواهد شد. در صورت نياز، تجزيهٔ نمونهٔ B به‌طور اختصاصى بر روى مواد يافته شده در نمونهٔ A متمرکز خواهد گرديد.

ليست مواد رنگى منتشره از سوى کميتهٔ بين‌المللى المپيک (IOC) مشتمل بر گروه بزرگ و متنوعى از فرآورده‌ها شيميائى است. به‌علاوه، مواد ديگرى هم هستند که در بعضى ورزش‌ها منع مصرف دارند. روش‌هاى آزمايش بايد قادر به يافتن هر کدام از اين مواد شيميائى باشند. وقتى قضيه پيچيده‌تر مى‌شود که بدانيم بسيارى از اين داروها در بدن متابوليزه مى‌شوند و لذا روش‌هاى تشخيصى بايد قادر به يافتن متابوليت‌هاى مربوطه هم باشند. روش‌هاى غربالگرى براى جداسازى و يافتن داروها و متابوليت‌هاى آنها در ادرار به‌کار مى‌روند. اين غربالگرى اوليه معمولاً و در ابتدا دستهٔ کلى مواد شيميائى را مشخص خواهد کرد. روش ثانويه آزمايش، با کمک تجزيهٔ مجدد نمونه و با هدف تشخيص دقيق ماهيت دارو يا متابوليت آن، براى اثبات به‌کار خواهد رفت.

روش‌هاى ديگر آزمايشگاهى که در اين راه به‌کار مى‌روند شامل کروماتوگرافى با غشاء نازک (TIC)، کروماتوگرافى گازى خواه به تنهائى و يا همراه با طيف‌سنجى حجمي، کروماتوگرافى مايع با عملکرد بالا (HPLC) و يا عيارسنجى ايمنى مى‌باشند.

کروماتوگرافى با غشاء نازک (TLC - Thin layer chromatography)

انواع مختلفى از کروماتوگرافى وجود دارند که در اين ميان TLC از اولين روش‌هاى کشف شده است. کلاً در تمام روش‌هاى کروماتوگرافى از يک مادهٔ واسط (Medium) استفاده مى‌شود که در سطح آن با عبور نمونه، جذب مواد شيميائى صورت مى‌پذيرد. مواد شيميائى متعددى با شدت‌هاى متفاوت به اين سطح مى‌چسبند و بنابراين با سرعت‌هاى گوناگون از ميان مادهٔ واسط گذر مى‌کنند. اين تکنيک براى جدا کردن مخلوطى از مواد شيميائى به‌کار مى‌رود و خصوصيات احتباسى (Retention properties) خاص هر يک از آنها وسيله‌اى براى تشخيص خواهد بود.

در مورد TLC، مادهٔ واسط لايه‌اى از سيليکاژل يا آلومينيوم است که به صفحه‌اى شيشه‌اى متصل شده است. در سمتى از صفحه قطره‌اى از نمونه ريخته شده و روى آن توسط لايهٔ نازکى از حلال پوشيده مى‌شود. با بالا رفتن آهسته ماده در صفحه، مواد شيميائى درون نمونه با حلال حرکت کرده، ولى وابسته به شدت چسبندگى خود به آلومينيوم يا سيليکاژل، با سرعت‌هاى مختلفى طى مسير مى‌کنند. پس از مدتي، صفحه‌ها از حلال جدا شده و فاصلهٔ طى شده توسط حلال روى آنها علامت زده مى‌شود. صفحه را سپس خشک کرده و با مواد مشخص‌کننده توانائى نمودار ساختن مواد شيميائى روى صفحه را داشته باشند، اسپرى مى‌زنند. محل آنها، به نسبت حلال مربوطه براى تشخيص خود ماده کمک خواهد کرد.

با اينکه TLC نتايج سريعى را با هزينهٔ نسبتاً اندک فراهم کرده و براى غربالگرى طيف وسيعى از داروها به‌کار مى‌رود، اما فاقد درجهٔ حساسيت بالا است. امروزه هم به‌ندرت در آزمايشگاه‌هاى IOC به‌کار مى‌رود و فقط محدود به تست غربالگرى اوليه است.

کروماتوگرافى مايع با عملکرد بالا (HPLC - High performance liquid chromatography)

در اين روش، قسمتى که داروها را جذب مى‌کند در يک ستون فشرده شده و حلال تحت فشار بالا به درون ستون رانده مى‌شود. مخلوط مواد شيميائى با سرعت‌هاى مختلف از آن گذشته و هر دارو از روى زمان احتباس خاص خود در ستون شناسائى مى‌شود. به‌علاوه بسيارى از داروها پس از ترک ستون توسط اشعهٔ ماوراء بنفش تشخيص داده مى‌شوند. با انتخاب طول موج‌هاى مناسب، آشکارساز (Detector) مى‌تواند نوع و ميزان دارو در ادرار را مشخص کند.

کروماتوگرافى گازى (GC - Gas chromatography)

در اين حالت هم قسمت جذب‌کنندهٔ داروها در يک ستون موئينه‌اى فشرده شده که از ميان آن گازى مثل هليم يا هيدروژن عبور مى‌کند. ستون گرم شده و هنگامى که دارو به دمائى رسيد که آن را درت موقعيت فرّار قرار داد، با کمک گاز به آشکارساز هدايت مى‌شود. آشکارسازها قادر به نشان دادن وجود اتم‌هاى خاص نظير نيتروژن يا فسفر هستند. پس کروماتوگرافى گازى در حقيقت روشى است که فقط نشان‌دهندهٔ وجود دارو در ادرار است. براى مشخص کردن دقيق نوع داروى مورد سؤال، کروماتوگرافى گازى بايد با طيف‌سنجى جرمى همراه شود.

طيف‌سنجى جرمى (Mass spectrometry)

روشى است که آزمايش‌کننده را قادر به تشخيص داروى خاص موجود در ادرار مى‌کند. در اين روش داروى اصلى و متابوليت‌هاى آن در معر‌ض پرتوى الکترونى بمباردمان شده و به اجزاء سازندهٔ خود تجزيه مى‌شوند. سپس ماشين، سطح اين سازنده را به‌صورت گرافيکى ترسيم خواهد کرد. طيف جرمى حاصله براى هر دارو منحصر به فرد است.

استفادهٔ توأم از کروماتوگرافى گازى و طيف‌سنجى جرمى روشى را براى شناسائى مناسب دارو در ادرار پيش رو مى‌گذارد که به اعتقاد عدهٔ زيادي، درصد خطاى ان بسيار ناچيز است. طيف‌سنجى جرمى را مى‌توان به‌عنوان آزمونى براى تأييد تست‌هاى غربالگرى کروماتوگرافى يا عيارسنجى ايمنى به‌کار گرفت.

عيارسنجى ايمنى (Immunoassay)

اين روش بر پايهٔ پاسخ آلرژيک بدن به مادهٔ خارجى وارد شده به آن استوار است. جسم خارجى به‌عنوان آنتى‌ژن تلقى شده و سيستم ايمنى بدن، آنتى‌بادى‌هائى را براى شناسائى و مقابله با آن توليد خواهد کرد. داروها هم به نوعي، دسته‌اى از آنتى‌ژن‌ها تلقى مى‌شوند. مى‌توان آنتى‌بادى‌هاى ويژه‌اى را در آزمايشگاه ساخت که به‌صورت اختصاصى به دستهٔ داروئى خاصى متصل شوند. اين آنتى‌بادى‌ها در حالت طبيعى شامل يُد راديواکتيو (در روش راديوايمونواسى - Radioimmunoassay يا RIA) و يا آنزيم گلوکز ۶-فسفات دهيدروژناز (در روش ايمونواسى آنزيمى - Enzyme innunoassay يا EIA) مى‌باشند. نمونه‌هاى ادرارى را با اين آنتى‌بادى‌ها مجاور مى‌کنند و در صورت وجود داروئى که آنتى‌بادى قادر به تشخيص آن باشد، دارو به آنتى‌بادى مربوطه متصل خواهد شد. اين کمپلکس دارو و آنتى‌بادى با کمک يکى از روش‌هاى عيارسنجى قابل تفکيک و شناسائى است.