تولید سلولز به کمک باکتری در محیط کشت ایستا و محرک

سلولز یکی از پرمصرف ترین مواد طبیعی جهت تولید کاغذ, منسوج و غیره می باشد با توجه به محدودیت منبع اصلی سلولز که همان چوب می باشد و حفظ منابع طبیعی, محققان در زمینه تولید سلولز غیرطبیعی و یا جایگزین نمودن آن تلاش های بسیار انجام داده اند

● چکیده

سلولز یکی از پرمصرف‌ترین مواد طبیعی جهت تولید کاغذ، منسوج و غیره می‌باشد. با توجه به محدودیت منبع اصلی سلولز که همان چوب می‌باشد و حفظ منابع طبیعی، محققان در زمینه تولید سلولز غیرطبیعی و یا جایگزین نمودن آن تلاش‌های بسیار انجام داده‌اند.

یکی از روش‌های بسیار جالب تولید سلولز مصنوعی روش باکتریائی یا میکروبی می‌باشد که سلولز حاصله را سلولز باکتریائی میکروبی می‌نامند. جهت این امر از باکتری‌های مختلفی بهره‌می‌برند که در میان آنها Acetobacter بسیار مشهور بوده و مورد استفاده قرار گرفته است. این‌گونه باکتری‌ها از طریق فرآیند بیولوژیکی (تخمیر) با استفاده از گلوکز و یا انواع دیگر شکرهای موجود، گیسرول و یا حتی موادآلی دیگر تولید زنجیره‌های سلولز می‌نمایند.

● مقدمه

سلولز بیوپلیمر اصلی زمین است و از نظر اقتصادی اهمیت فراوانی دارد. سلولز سازنده اصلی پنبه (بیش از ۹۴%) و چوب (بیش از ۵۰%) می‌باشد. بنابراین پنبه و چوب درختان منابع اصلی برای همه محصولات سلولزی مانند کاغذ، منسوجات، مواد ساختمانی و مقوا می‌باشد. با افزایش جمعیت و افزایش تقاضا در مورد مصرف سلولز ممکن است یک ضربه مستقیم به چرخه کربنی زمین وارد شود، چرخه کربنی زمین یک فعل و انفعال وسیع ما بین دی‌اکسید کربن هوا و موادآلی در گیاهان است که نور خورشید صورت گرفته و منجر به تولید سلولز می‌شود. میزان تولید سالیانه سلولز که به مصرف می‌رسد در حدود ۱۱ تن برآورده شده است.

جهت خالص‌سازی سلولز و به‌دست آوردن سلولزی تمیز و سفید از فرِآیندهای فیزیکی و شیمیائی مختلفی نظیر عملیات سفیدگری بهره می‌گیرند که می‌تواند بر پیکره سلولز آسیب‌های شدید و جبران‌ناپذیری وارد نمایند و باعث افت خصوصیات ذاتی سلولز نظیر استحکام و دوام شود.

یکی از راهکارهای ارائه شده جهت جایگزین منابع متداول و رایج سلولز، تولید سلولز میکروبی می‌باشد. که می‌تواند آسیب‌رسانی به منابع چوبی را کاهش داده و در زمان، هزینه، انرژی و همچنین حفظ خصوصیات سلولز بسیار مؤثر باشد. علاوه بر آن فرآیند تولید سلولز تحت کنترل بوده و می‌توان تغییرات جزئی لازم را بر سلولز حاصله اعمال نمود.Acetpbacter Xylinum یکی از مشهورترین باکتری‌هائی است که تاکنون جهت سنتز سلولز به‌کار رفته است.

در محیط کشت باکتری Acetobacter Xylinum که نوعی باکتری گرم منفی، هوازی و میله‌ای است. سلولز در سطح مشترک مایع محیط کشت با هوا تولید می‌شود. این سلولز حاصله به‌خودی خود خالص بوده و عاری از لیگنین و همی سلولز (دو ناخالصی اصلی سلولز طبیعی) می‌باشد، دارای درجه پلیمریزاسیون بالائی می‌باشد و نیازی به انجام فرآیند نظیر پخت و سفیدگری ندارد، ضمن آنکه توسط این باکتری امکان تولید سلولز رنگی، مشتقات سلولز و نیز سلولزی با قابلیت‌های خاص نیز می‌باشد.

● کشت میکروب جهت ایجاد سلولز

برای ایجا سلولز خالص نیاز است تا باکتری تولیدکننده سلولزی در محیطی مناسب کشت شود و با دادن زمان به فرآیند کشت، زنجیره‌های سلولزی تک به تک شکل‌یافته و سلولز حاصل خواهد شد.سلولز باکتریائی را از نژادهای مختلفی می‌توان تهیه کرد، تعدادی از این نژادهای معروف به شرح زیر است

(Acetobacter Xylinum NQ۵ (ATCC۵۳۵۸۲

(Acetobacter Xylinum BPR۲۰۰۱ (Sucro fermentans

Acetobacter Xylinum BPR۳۰۰۱E

Bcetobacter Xylinum ATCC۲۳۷۶۹

● انواع محیط‌های کشت باکتری

جهت کشت باکتری از دو نوع محیط کشت استفاده شده است:

۱. محیط کشت ایستا (ساکن):

که منجر به انباشتگی یک غشاء ژلاتینی سلولزی مناسب خواهد شد.

۲. محیط کشت محرک:

که سلولز در عمق متوسط در سوسپانسیون‌های لیفی، به شکل قرص، یا جرم‌های نامعین سنتز می‌شود.

طی چندین بررسی انجام شده مشخص گردیده که محیط کشت ایستا میزان سلولز بیشتری را در ازاء زمان معینی نسبت به محیط کشت محرک تولید می‌کند، اما در واقع سلولزی که در محیط کشت محرک تولید شده است خواص مطلوب‌تری را نسبت به سلولز حاصل از ایستا دارد. البته این شرایط به عوامل مختلفی از جمله شرایط تخمیرنژاد تولیدکننده سلولز و سیستم تخمیر آن بستگی دارد. بهینه‌سازی فرآیند تخمیر موجب انجام فرآیند بیوسنتز سلولز با راندمان تولید بیشتر خواهد شد. در این رابطه می‌توان سیستم تخمیز Air Lift reactor که یکی از مناسب‌ترین تخمیرکننده‌های صنعتی می‌باشد را نام برد.

● بررسی ساختار سلولز میکروبی تولیدشده در محیط‌های کشت ایستا و محرک

چندین تحقیق در زمینه‌های گوناگون بر روی محصولات سلولزی حاصل از باکتری‌ها صورت گرفته است، یکی از این بررسی‌ها که توسط محققین دانشکده میکروبیولوژی انجام شده است، به شرح زیر است:

در این بررسی هدف اصلی مشاهده تفاوت ظاهری و خصوصیات فیزیکی و شیمیائی سلولز کشت شده در محیط کشت ایستا و محرک می‌باشد.

میکروارگانیسم مورد استفاده نژاد (Acetobacter Xylinum NQ۵ (ATCC۵۳۵۸۲ از بخش جمع‌آوری مولکول‌های ژنتیکی و میکروبیولوژیکی دانشگاه ای‌اندبی ‌تگزاس، برای انجام این فرآیند استفاده شده است.

●محیط کشت میکروب

محیط شارم ـ هیسترین بدون تغییرات PH که در همه مراحل آزمایش به‌جزء موارد خاص از جمله شستشو، مصرف شده است.

●شرایط محیط کشت

سلول‌ها در فلاکس‌های ثابت یا بر روی یک صفحه لغزنده چرخان با افزودن ۱/۰% آنزیم سولاز به مدت ۳ روز در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد کشت شده‌اند سپس سلو‌ل‌ها توسط سانتریفوژ و یا نیروی گریز از مرکز جمع‌آوری شده و آنها را مجدداً در محیط کشت تازه معلق نمودند (به حالت سوسپانسیون درآوردند) این محیط تازه درون ظروف فلاکس مانند ثابت یا بر روی یک لغزنده چرخان با سرعت‌های گردش مختلف (در حدود ۹۰ تا ۲۵۰rpm) برای ۷ روز در دمای ۲۸ْc رشد داده شدند. سلولز سنتز شده در محیط کشت توسط فیلتر کردن، جداسازی شده است. مقدار سلولز تولید شده به‌صورت جرم خالص پلیمر بعد از شستشو توسط هیدروکسید سدیم ۲%، ۳ مرتبه با آب مقطر نیز شسته شدند، تا برای جابه‌جائی و ورود به محیط سلولزی، آماده گردند.

● مشاهدات

بررسی میکروسکوپی محصولات در این فرآیند در جهت مقایسه سلولز تولید شده در محیط کشت ایستا و سلولز تولید شده در محیط کشت محرک از نظر ساختمان سطحی و داخلی، صورت گرفت است. این بررسی‌ها شامل مشاهدات میکروسکوپ‌های الکترونیکی پویشی (SEM) و نوری بوده است.سنتز سلولز در ازاء زمان عمل‌آوری در هر دو محیط کشت ایستا و محرک در شکل ۲ نشان داده شده است.

با گذشت هفت‌روز از شروع کار محیط کشت، مقدار سلولزی که تولید شده است، پس از چندین روز فراز و نشیب سرانجام در محیط کشت ایستا بیشتر بوده است.

در این آزمایش پس از گذشت ۱۶ روز افزایش قابل توجهی در سنتز سلولز در محیط کشت محرک پیدا نشد، در حالی‌که غشاء نازکی در محیط کشت ایستا جرم حجمی خشک در حدود ۱۰g/lit رشد پیدا کرد. یکی از استدلال‌های محتمل می‌تواند آن باشد که در محیط کشت ایستا، راه‌های مختلف پخش اکسیژن و نفوذ آن در اجزاء در حین رشد، تمرکز می‌یابد. زمانی‌که مکانیسم شکل‌گیری پلیمر و پروفیل اکسیژن از تحقیقات اخیر حاصل شد، توجه زیادی به تجمع سلولز در شرایط محیط کشت محرک صورت نگرفت. فرم کره‌های کوچک (گویچه‌ها) سلولز که توسط نژاد NG۵ در سیست کشت محرک حاصل شده‌اند در شکل ۳ نشان داده شده است.

قسمت‌های موجود که بیشتر سلول‌ها در سطح گویچه‌ها ایجاد شده‌اند و فقط کمی از آنها به‌درون پخش شده‌اند. سلول‌هائی که در محیط تازه و جدید هستند تا زمانی‌که به سطح نزدیک هستند و دسترسی به هوای تازه و اکسیژن دارند رشد می‌کنند . در این‌حالت گویچه‌ها به‌هم پیوسته و تشکیل نوارهای سلولزی مناسب را می‌دهند. به این ترتیب یک سطح سلولزی با ابعاد ظروف محیط کشت پدید خواهد آمد.در یک فرضیه که به توصیف سطح سلولز می‌پردازد، پیشنهاد شده است که سلولز فقط در سطح سنتز گردد و اینکه سلول‌های زیرین از بین می‌روند، به‌ این دلیل که در غشاء نازکی که از محیط کشت ایستا (ساکن) حاصل شده است، سنتز فقط بر روی سطح صورت گرفته است. شاید تنش‌های برشی در سیستم کشت محرک، در اثر تحرک سلول‌ها، باعث جداشدن آنها از سطح گویچه‌ها شوند. در یک فرضیه دیگر، سلول‌ها ممکن است یک فاز سنتز دوره‌ای داشته باشند که توسط آن سلول‌ها واقعاً یک چرخه سنتز دارند، جداسازی گویچه‌ها به معنای برخورد با گویچه‌های دیگر است و سنتز نواری سلولزی را به‌همراه دارد. این فرضیه می‌تواند روشن کند که چرا این گویچه‌های سلولزی طوری حاصل می‌شوند که دارای مرکزی متراکم‌تر از سطحشان باشند.

---