ایمنی سنجی به چند روش

اساس این روش ها مانند سنجش های ایمنی رادیواكتیو همان واكنش آنتی ژن آنتی بادی است, با این تفاوت كه جهت ردیابی واكنش مذكور به جای رادیواكتیویته از آنزیم ها و واكنش های آنزیمی استفاده می شود

● روش‌های مختلف سنجش ایمنی و بررسی مزایا و معایب آنها

مقوله روش‌های مختلف سنجش مواد یكی از مهم‌ترین شاخه‌های تحقیقاتی به‌شمار می‌آید كه گاه نقاط عطفی در این میان پدید می‌آمده و روش جدیدی مطرح می‌گردد و تا رسیدن به روشی تازه، تحقیقات در جهت اصلاح و بهبود روش قبلی ادامه می‌یابد. بدیهی است كه هر روش معایب و محاسن خود را داشته و با توجه به این ویژگی‌ها گسترش یافته یا محدود می‌شود. گاهی نیز روش‌های جدید جایگزین روش‌های قبلی نیست، بلكه به موازات آنها از محدودیت‌های موجود می‌كاهند.

تا نیمه اول قرن بیستم به كمك روش‌های اندازه‌گیری دستگاهی (Instrumental Analysis)، سنجش‌های دقیق و حساسی جهت اندازه‌گیری آنالیت‌ها (Analytes) به‌كار می‌رفت. از آنجایی كه خواص فیزیكوشیمیایی مورد استفاده در تشخیص و اندازه‌گیری آنالیت‌ها اغلب از ویژگی لازم برخوردار نبودند، لذا از ادغام دو روش جداسازی و اندازه‌گیری، روش‌های جدیدی ایجاد شد. مثلاً روش رنگ‌سنجی (Colorimetery) ساده می‌توانست به دلیل جذب نوری تركیبات مشابه آنالیت، پاسخ‌های مثبت كاذب به وجود آورد اما روش قدرتمندی مانند كروماتوگرافی با كارایی بالا ابتدا تركیبات مشابه را از هم جدا كرده، سپس به سنجش هر كدام می‌پردازد.

امروزه انواع روش‌های دستگاهی جهت سنجش‌های ویژه و حساس آنالیت‌ها طراحی و در دسترس محققان قرار گرفته‌ است.

با پیشرفت جوانب مولكولی علوم مختلف، نیازی به اندازه‌گیری روزانه بسیاری از آنالیت‌ها احساس می‌شد، اما روش‌های دستگاهی مذكور برای این امر محدودیت‌هایی داشتند. از جمله این محدودیت‌ها می‌توان به

هزینه بالای خرید دستگاه مذكور، هزینه بالای مواد مصرفی و نگهداری دستگاه، نیاز به تخصص كافی كاربر، زمان طولانی سنجش و محدودیت تعداد اندازه‌گیری روزانه اشاره كرد.

در ابتدای نیمه دوم قرن بیستم، محصول سیستم ایمنی هومورال یعنی آنتی‌بادی‌ها یكی از نقاط عطف مورد بحث را به وجود آورد. آنتی‌بادی‌ها با اتصال ویژه به آنالیتی كه بر ضد آن تهیه شده ‌است به عنوان ابزاری مناسب برای سنجش‌های ویژه و سریع در اختیار محققان قرار گرفت. روش‌هایی كه از آنتی‌بادی‌ها به عنوان فاكتور شناساگر بهره می‌گیرد، روش‌های سنجش ایمنی نام دارد. ابداع این روش به سال ۱۹۵۹ برمی‌گردد.

«Yalow» و «Berson» محققانی بودند كه با استفاده از آنتی‌ژن نشان‌دار (رادیواكتیو) و آنتی‌بادی ویژه، هورمون انسولین را برای اولین بار مورد اندازه‌گیری قرار دادند. آنها كه در سنجش خود از محصول سیستم ایمنی و رادیواكتیویته استفاده كرده بودند، روش مذكور را سنجش ایمنی رادیواكتیو نام نهادند.

● اساس روش‌های سنجش ایمنی

شناسایی آنالیت، اولین مرحله در این نوع سنجش محسوب می‌شود. این عمل توسط آنتی‌بادی‌ انجام می‌پذیرد. به عبارتی، جزء لاینفك هر سنجش ایمنی واكنش میان آنتی‌ژن و آنتی‌بادی است.

در برخی موارد در محدوده معینی از غلظت آنتی‌ژن و آنتی‌بادی انجام واكنش منجر به تشكیل رسوب قابل رؤیت (قبل یا بعد از رنگ‌آمیزی) می‌گردد. اما در اغلب موارد، قبل و بعد از انجام واكنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی تغییر قابل مشاهده‌ای وجود ندارد، به همین دلیل وجود سیستم نشانه‌گذاری ضروری به نظر می‌رسید. همان‌طور كه اشاره شد در اولین سنجش كمی ایمنی، محققان از مواد رادیواكتیو برای نشاندار سازی استفاده نمودند.

جالب است بدانید یك نوع طبقه‌بندی سنجش‌های ایمنی بر اساس نام نوع نشاندارسازی سنجش بنا شده است. به عنوان نمونه، سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو، سنجش‌های ایمنی آنزیمی، سنجش‌های ایمنی فلوئورسانس و ... به دلیل قدمت سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو ابتدا به شرح مختصر این روش، خصوصیات و معایب آن خواهیم پرداخت.

● سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو

در واكنش میان آنتی‌ژن و آنتی‌بادی هر كدام از این دو جزء را می‌توان با ماده رادیواكتیو نشاندار ساختو از لحاظ ردیابی كمپلكس ایجاد شده، تفاوتی میان جایگاه اتصال ماده رادیواكتیو وجود ندارد هر چند كه با همین تغییر ایگاه نشاندارسازی برخی از پارامترهای متدولوژیك دچار تغییر خواهند شد. چنانچه آنتی‌ژن با ماده رادیواكتیو نشاندار شود، سنجش را RIA (Radio Immuno Assy) می‌نامند.

اساس روش RIA رقابت میان آنتی‌ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی‌بادی است. از آنجایی كه هر قدر میزان آنتی‌ژن موجود در نمونه سنجش بیشتر باشد، آنتی‌ژن رادیواكتیودار كمتری به آنتی بادی متصل می‌شود، میزان كمپلكس رادیواكتیو با آنتی‌ژن غیر رادیواكتیو رابطه معكوس دارد.

از آنجایی كه تماس ماده رادیواكتیو با سطح پوست بدن گرما و سوزش ایجاد می‌كند، لذا برخی محققان آنتی‌ژن رادیواكتیودار را آنتی‌ژن گرم و آنتی‌ژن غیررادیواكتیو را آنتی‌ژن سرد نامیده، اساس RIA را رقابت بین آنتی‌ژن سرد و گرم می‌دانند.

این روش سه جزء اصلی دارد: آنتی‌بادی، آنتی‌ژن سرد و آنتی ژن گرم.

با توجه به اینكه آنتی‌بادی بر علیه شاخص‌های مختلف آنتی‌ژن، تولید خواهد شد آنتی‌بادی مذكور را كه محصول كلون‌های مختلف سلولی است، آنتی‌بادی پلی كلونال می‌گویند. با پیشرفت تكنیك‌ هیبریدوما امروزه آنتی‌بادی‌های منوكلونال ویژه‌ای برای سنجش انواع آنالیت‌ها در دسترس است. لازم به یادآوری است كه به اشتباه برخی افراد آنتی‌بادی منوكلونال را ویژه‌تر از آنتی‌بادی پلی كلونال می‌دانند در حالی كه الزاماً رابطه مستقیمی میان ویژگی و نوع آنتی‌بادی وجود ندارد. یعنی آنتی‌بادی منوكلونال می‌تواند ویژگی برابر، كمتر و یا بیشتر از آنتی‌بادی پلی كلونال داشته باشد، هر چند در اغلب سنجش‌ها ما از آنتی‌بادی‌های منوكلونال ویژه استفاده می‌شود.

اما لفظ منوكلونال فقط گویای این مطلب است كه آنتی‌بادی مذكور از یك كلون سلولی ترشح شده است. چنانچه كلون مذكور برعلیه شاخص آنتی‌ژنی ویژه‌ای تشكیل شده باشد، آنتی‌بادی مذكور نیز ویژه خواهد بود. در مورد آنتی‌ژن گرم همواره دو حالت وجود دارد:

در حالت اول اتم رادیواكتیو به صورت طبیعی در ساختمان آنتی‌ژن وجود دارد با این تفاوت كه اتم مذكور در آنتی‌ژن سرد رادیواكتیو نیست ولی در آنتی‌ژن گرم ایزوتوپ رادیواكتیو آن به‌كار رفته است. مثلاً هورمون تیروكسین یا T۴ در ساختمان خود دارای چهار اتم ید است.

در سیستم RIA آنتی‌ژن گرم برای مثال بالا همان مولكول T۴ است، با این تفاوت كه به جای ید طبیعی از ایزوتوپ رادیواكتیو آن یعنی ید ۱۲۵ استفاده شده است. در حالت دوم اتم رادیواكتیو در ساختمان آنتی‌ژن طبیعی یا آنتی‌ژن سرد وجود ندارد. مثلاً در سنجش RIA هورمون انسولین، طی یك واكنش شیمیایی ید ۱۲۵ را روی حلقه‌های تیروزین ساختمان انسولین جای می‌دهند؛ لذا حلقهٔ تیروزین در ساختمان آنتی‌ژن سرد فاقد اتم ید است در حالی كه در آنتی‌ژن گرم دارای اتم ید رادیواكتیو است در حالت اول از لحاظ ساختمان شیمیایی تفاوتی میان آنتی‌ژن سرد و گرم وجود ندارد اما در حالت دوم باید مراقب بود تا افزایش ماده رادیواكتیو شاخص آنتی‌ژنی آنالیت را تحت تأثیر قرار ندهد، زیرا این امر می‌تواند واكنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را كه اساس روش سنجش است، متأثر سازد.

به طور كلی در روش RIA، آنتی‌ژن سرد و آنتی‌ژن گرم بر سر اتصال به مقدار معین و محدودی از آنتی‌بادی با هم رقابت می‌كند. با توجه به اینكه اساس این روش رقابت است و رقابت در محدودیت معنا می‌یابد، لذا به این روش، معرف محدود (Restricted Reagent) نیز می‌گوید. در این روش ابتدا رقابت میان مقادیر متفاوت و معینی (استاندارد) از آنتی‌ژن سرد با مقدار معین و ثابتی از آنتی‌ژن گرم بر سر اتصال مقدار معین و محدودی از آنتی‌بادی ایجاد می‌شود كه ماحصل آن به دست آمدن منحنی استاندارد است.

با توجه به رابطهٔ معكوس میان كمپلكس‌ رادیواكتیو و میزان آنتی‌ژن سرد، همواره منحنی‌های استاندارد شكلی نزولی دارد. در منحنی استاندارد همیشه محور xها نشان‌دهندهٔ غلظت آنتی‌ژن سرد و محور y ها نشان‌دهنده میزان كمپلكس رادیواكتیو بر حسب CPM (Count per Minute) است. همان‌طور كه می‌دانید رادیواكتیویته و ناپایداری هسته برخی از ایزوتوپ‌های اتمی یك پارامتر ثابت فیزیكی است و همانگونه كه در اساس روش RIA ذكر شد میزان آنتی‌ژن گرم، همواره ثابت و معین است.

بنابراین میزان رادیواكتیویته تمام غلظت‌های استاندارد با هم برابر بوده، همواره منحنی استاندارد به صورت خطی موازی محور xها خواهد بود. یعنی به‌‌رغم اینكه میان كمپلكس رادیواكتیو در هر غلظت استاندارد متفاوت است اما میزان رادیواكتیویته كل هر نقطه استاندارد با سایر نقاط برابر است، لذا در این مرحله نیازبه جداسازی آنتی‌ژن گرم از كمپلكس رادیواكتیو وجود دارد. مرحله جداسازی با روش‌های متفاوتی امكان‌پذیر است ذكر جزئیات آن از حوصله این مقاله خارج است.

بعضی از این روش‌ها عبارتند از: استفاده از آنتی‌بادی دوم، استفاده از محلول‌های پلیمری مانند PEG، استفاده از تثبیت آنتی‌بادی‌ها، استفاده از ذرات مغناطیس و ...

پس از مرحله جداسازی رابطه معكوس بین غلظت آنتی‌ژن سرد و كمپلكس رادیواكتیو می‌تواند مبنای سنجش آنتی‌ژن موجود در نمونه مورد بررسی باشد. یعنی می‌توان از میزان كمپلكس رادیواكتیوی كه در مجاورت آنتی‌ژن سرد مجهول تشكیل می‌گردد با استفاده از منحنی استاندارد به میزان آنتی‌ژن سرد پی برد.

در هر حال، امروزه اغلب روش‌های IRMA به صورت غیررقابتی و ساندویچی اجرا می‌گردند. یعنی آنالیت توسط دو آنتی‌بادی ساندویچ می‌گردد كه یكی از این آنتی‌بادی‌ها توسط ماده رادیواكتیو نشاندار شده است. در این روش به ازای هر آنالیت یك ساندویچ نشاندار تشكیل می‌گردد، لذا رابطه مستقیم میان آنالیت و كمپلكس رادیواكتیو برقرار است.

در عمل، ابتدا به ازای مقادیر معین آنالیت (استانداردها) كمپلكس‌های رادیواكتیو تشكیل می‌گردد. غلظت آنالیت‌ روی محور x ها و میزان كمپلكس رادیواكتیو (CPM) روی محور yها قرار گرفته و بدین ترتیب منحنی صعودی كه نشانه رابطه مستقیم غلظت آنالیت با كمپلكس رادیواكتیو است، تشكیل می‌گردد.بر اساس میزان كمپلكس رادیواكتیو در نمونه‌های مجهول و استفاده از منحنی‌ فوق، غلظت آنالیت مجهول محاسبه می‌گردد.

● مزایای روش RIA به IRMA

۱) در روش RIA مولكول‌های آنتی‌ژن اغلب از جنس هاپتن (مولكول‌هایی با جرم مولكولی كمتر از ۱۰۰۰ دالتون) است. مانند انواع هورمون‌های استروئیدی، داروها، هورمون‌های تیروئیدی و ... محدودیت گروه‌های عامل (Functional Group) در مولكول‌های مورد نظر، نشاندارسازی را محدود ساخته، اغلب نیاز به واكنش‌های تخصصی و پیچیده دارد، اما در روش IRMA همیشه نشاندارسازی روی مولكول پروتئین بزرگ آنتی‌بادی انجام می‌گیرد. این مولكول‌ بزرگ دارای انواع گروه‌های عملكردی است كه به‌راحتی با روش‌های ساده و عمومی می‌توان آنها را نشاندار ساخت،

۲) یكی از پارامترهای متودولوژیك، ویژگی (Specificity) است. در روش RIA با استفاده از یك آنتی‌بادی، شناسایی منفرد (Single recognition) صورت می‌گیرد، در حالی كه در روش IRMA استفاده از دو آنتی‌بادی منوكلونال ویژه، ویژگی را افزایش می‌دهد،

۳) حساسیت همواره یكی از مشخصات مهمی است كه در طراحی روش‌های مدنظر محققان قرار می‌گیرد. در روش RIA اساس، رقابت بوده در یك محدوده معین از غلظت رابطه‌ای میان نسبت رقابت و كملپكس رادیواكتیو وجود دارد، لذا حساسیت IRMA به دلیل وجود رابطه یك به یك میان آنالیت و كمپلكس رایدواكتیو از RIA بیشتر است. در روش IRMA جایگاه‌های نشاندار‌سازی بالقوه از روش RIA بیشتر است، لذا تعداد سیگنال‌های دریافتی یا به عبارتی حساسیت بالاتر می‌رود. در پیشرفت دستگاهی، چنانچه دستگاه حساس‌تری طراحی شود به طوری كه به CPM‌های پایین حساسیت بیشتری داشته باشد، در روش RIA به خوانش غلظت‌های پایین یاری می‌رساند و می‌دانید كه حساسیت با غلظت‌های پایین مرتبط است،

دكتر مجتبی صلوتی، گروه میكروبیولوژی، دانشگاه آزاد زنجان

مهندس فرانك سقطچی، گروه رادیولوژی، دانشگاه علوم پزشكی زنجان

دكتر احمد بیطرفان رجبی، بخش پزشكی هسته‌ای بیمارستان قلب شهید رجایی

منابع:

۱- اصول علمی الایزا، دكتر محمودجواد رسایی

۲- آشنایی با مبانی تئوری الایزا، دكتر مهدی هدایتی

۳- ایمونولوژی رویت، ایوان رویت، مترجم: دكتر عطیه عبادی، سارا مظاهری

۴- هیتوشیمی در پاتولوژی، دكتر فرخ قوام

---