موارد استفاده EDTA بعنوان ماده ضدانعقاد

نمکهای Ethylenediaminetetra acetic Acid EDTA به علت حفظ سلولهای خونی بعنوان ماده ضد انعقاد مناسب در آزمایشگاههای هماتولوژی بکار می رود این ماده توانایی پیوند با تعدادی از عناصر را داشته و با اتصال به کلسیم می تواند آنرا از محیط خارج نماید کلسیم و دیگر یونهای دوظرفیتی می توانند بعنوان کوفاکتورهای آنزیم عمل نمایند و بهمین دلیل نمکهای EDTA جهت تعیین مقدار کلسیم, آهن, آلکالن فسفاتاز, کراتین کیناز و لوسین آمینو پپتید از مناسب نیستند

● مقدمه

نمکهای Ethylenediaminetetra-acetic.Acid) EDTA) به علت حفظ سلولهای خونی بعنوان ماده ضد انعقاد مناسب در آزمایشگاههای هماتولوژی بکار می رود. این ماده توانایی پیوند با تعدادی از عناصر را داشته و با اتصال به کلسیم می تواند آنرا از محیط خارج نماید. کلسیم و دیگر یونهای دوظرفیتی می توانند بعنوان کوفاکتورهای آنزیم عمل نمایند و بهمین دلیل نمکهای EDTA جهت تعیین مقدار کلسیم، آهن، آلکالن فسفاتاز، کراتین کیناز و لوسین آمینو پپتید از مناسب نیستند.

● موارد استفاده

EDTA جهت آزمایشات زیر در هماتولوژی توصیه می گردد.

▪ هماتوکریت (روش میکروهماکریت)

▪ شمارش پلاکت

▪ شمارش گلبولهای سرخ و سفید اندازه گیری هموگلوبین

▪ گسترش خون محیطی جهت افتراق سلولی

▪ شمارش رتیکولوسیت

▪ فلوسیتومتری

▪ سدیمانتاسیون (پس از تصحیح باسیترات سدیم). نمونه خون تهیه شده با ضد انعقاد EDTA در مدت ۶ ساعت در حرارت آزمایشگاه باید از آزمایش گردد. استفاده از EDTA در سایر موارد مثل اندازه گیری سیکلوسپورین (Cyclosporin) و عناصر بسیار کمیاب توصیه شده است. لازم به ذکر است که نمکهای EDTA می توانند با ظروف فلزی یا درب آنها واکنش نشان داده و یونهای فلزی را آزاد کنند بنابراین برای استفاده از EDTA باید از ظروف مناسبی استفاده شود.

● انواع EDTA

▪ EDTA به صورت اسید آزاد به تنهائی بعنوان ضد انعقاد مصرف نمی گردد. بیشتر نمکهای آن مورد استفاده قرار می گیرد. اسید آزاد آن دارای وزن ملکولی ۲/۲۹۲ و به صورت پودر سفید بدون بو می باشد. محلول اشباع آن (در ۲۰ درجه سانتیگراد) ۲۰۰۰ تا ۳۰۰ میلی گرم در لیتر است.

▪ EDTA دی سدیک به همراه دو ملکول آب (EDTA-NA۲, ۲H۲O) دارای وزن ملکولی ۲/۳۷۲ و به صورت پودر کریستال بدون بو می باشد. حلالیت آن در حرارت ۲۰ درجه سانتیگراد است.

▪ EDTA دی پتاسیک به همراه دو ملکول آب (EDTA-K۲, ۲H۲O) دارای وزن ملکولی ۴/۴۰۴ می باشد. این نوع بیشتر در اروپاو ژاپن استفاده می شود و به تازگی در آمریکا مورد توجه قرار گرفته است. این نمک نسبت به نمکهای دی سدیک از حلالیت بیشتری برخوردار است.

▪ EDTA تری پتاسیک (EDTA-K۳) دارای وزن ملکولی ۴۰۶ و بصورت مایعی شفاف، بدون بو می باشد، نوع خشک شده آن به صورت پودر سفید بدون بو است.

● PH نمکها

PH نمکهای تری پتاسیک نزدیک به PH خون (۸-۷) می باشد، این مقدار بالاتر از PH نمکهای دی سدیک (۳/۵–۵/۴) است، در تستهای خاصی که بستگی به شرایط اسیدی یا قلیائی دارند می توان با توجه به PH مورد لزوم EDTA مناسب را بکار برد. در PH کمتر از چهار، کمپلکس متصل به کلسیم پایدار نبوده و ممکن است تجزیه و جدا گردد.

● خواص ضد انعقاد

بطور کلی EDTA بعنوان یک ماده ضد انعقاد در تستهای انعقادی بکار نمی رود مگر هنگامیکه بررسی و آزمایش پلاکت مورد نظر باشد. باید توجه نمود که در بعضی بیماران بعلت وجود آنتی بادیهای پلاکتی، با وجود EDTA پلاکتها به صورت چسبیده به یکدیگر مشاهده می شوند، لذا در این موارد نباید EDTA مصرف گردد. در ضمن قابل ذکر است که فاکتور V در مقابل EDTA ناپایدار است.

● مقادیر لازم

میزان مصرف EDTA-K۳ ، ۲/۱ میلی گرم برای هر میلی لیتر خون است ولی EDTA دی پتاسیک و دی سدیک همراه با دو ملکول آب ۲۵/۰ ± ۵/۱ میلی گرم برای هر میلی لیتر خون مورد استفاده قرار می گیرد.

● پایداری نمونه

در حرارت آزمایشگاه بیشتر از ۶ ساعت از زمان گرفتن خون در لوله حاوی EDTA نباید بگذرد ولی در حرارت ۴ درجه سانتیگراد (یخچال) تا ۲۴ ساعت P.C.V, Hb, W.B.C, R.B.C, MCV, Platelet پایدار است.

مقدار EDTA مصرفی باید متناسب با مقدار خون باشد و اگر EDTA بیشتر از اندازه مصرف گردد گلبولهای سرخ و سفید چروکیده و منهدم می گردند که این به علت افزایش غلظت یونی می باشد. افزایش EDTA بیش از ۲ میلی گرم در میلی لیتر سبب کاهش قابل توجهی در P.C.V و در نتیجه افزایش MCHC می شود و نیز همین افزایش بر روی پلاکتها اثر گذاشته و سبب تورم و پاشیدگی آنها می شود، شمارش مجدد این ذرات پلاکنی سبب افزایش غیرواقعی تعداد پلاکتها می گردد. کاهش میزان EDTA باعث ایجاد لخته های ریز گردیده که تاثیر قابل توجهی در اندازه گیری پلاکتها می گذارند.

● تاثیر ماده ضد انعقاد روی انگل مالاریا

بهترین روش برای تشخیص انگل مالاریا استفاده از گسترش بدون ماده ضد انعقاد است که بطور مستقیم از خون مویرگی و یا وریدی تهیه شده باشد. ولی چون برخی از نمونه ها از سایر مراکز ارسال می گردد و یا انگل بطور اتفاقی همراه با ماده ضد انعقاد دریافت می شود لازم است که از اثرات ماده ضد انعقاد بر روی مالاریا اطلاع داشت.

کلیه مواد ضد انعقاد سبب تغییراتی در انگلهای مالاریا گردیده که با توجه به چرخه زندگی انگل، فاصله طی شده تا انجام آزمایش و نوع ماده ضد انعقاد مورد مصرف متفاوت می باشد.

چنانچه استفاده از ماده ضد انعقاد الزامی است بهتر است هر چه سریعتر گسترش را تهیه نمود.

ماده ضد انعقاد انتخابی EDTA دی پتاسیک است، این ماده برای مدت کوتاهی تغییراتی در روی انگل بوجود نمی آورد ولی اگر بیش از ۶ ساعت در مجاورت خون باشد سبب اختلالات زیر می گردد.

▪ مرحله تکامل جنسی سیر خود را ادامه خواهد داد و میکروگامتوسیت پس از بلوغ گامتوسیت را داخل خون آزاد می کند. این گامتها در تشخیص افتراقی با بورلیا قرار می گیرند.

گامتوسیتهای هلالی شکل پلاسمودیوم فالسیپارم بدور خود جمع شده شبیه پلاسمودیوم مالاریا می شوند.

▪ تروفوئیت بالغ پلاسمودیوم ویواکس در اثر تماس طولانی با EDTA بهم فشرده شده و اگر این زمان بیش از اندازه طولانی باشد گلبولهای سرخ حاوی گامتوسیت و شیزونت بالغ همراه انگل نابود میشوند ولی رنگدانه هموزین مالاریا همیشه پایدار است و می تواند برای یک فرد با تجربه کمکی در جهت یافتن و حتی تشخیص نوع انگل باشد.

▪ نمای گلبول سرخ با دندانه دار شدن و رویهم قرار گرفتن دیواره سلولی تغییر می کنند.

▪ گلبولهای سرخ منقوط (مبتلا به پلاسمودیوم ویواکس) قابل رویت نخواهد بود.

هر گاه نمونه برداری در اتر EDTA تغییرات قابل توجهی نشان دهد بهتر است نمونه گیری را تکرار نموده و در این صورت گسترش را به صورت مستقیم و بدون استفاده از ماده ضد انعقاد تهیه نمود.

● تشخیص EDTA

روشهای متفاوتی جهت تشخیص انواع EDTA وجود دارد که ساده ترین آن عبارتست از :

دو قطره از محلول تیوسیانات آلومینیوم (۸ گرم درصد میلی لیتر آب مقطر) و دو قطره از محلول کلرور فریک (۹ گرم درصد میلی لیتر آب مقطر) را به ۵ میلی لیتر آب مقطر بدون یون در لوله آزمایش اضافه می کنیم محلول قرمز رنگی حاصل می شود. تقریباً در حدود ۵۰ میلی گرم نمک مورد نظر را به محلول فوق اضافه کرده در صورت وجود EDTA ، رنگ قرمز تبدیل به زرد خواهد شد.

▪ روش کالیبراسیون

بمنظور اطمینان از صحت نتایج بدست آمده از دستگاههای شمارنده سلولی نیاز به کالیبراسیون (تنظیم) دقیق میباشد و هر آزمایشگاهی باید برای دستگاه خود یک روش کالیبراسیون مستند داشته باشد.

قبل از کالیبراسیون باید تمام قسمتهای دستگاه و کلیه تجهیزاتی که جهت کالیبراسیون استفاده میشود مورد بررسی قرار گیرد. در دستگاههایی که فاقد کالیبراسیون اتوماتیک می باشند. ۲۰ نمونه خون (نرمال و غیرنرمال) تهیه نموده و هر نمونه را ۳ بار بروش دستی و ۳ بار بروش دستگاهی جهت پارامترهای مورد نظر اندازه گیری می نمائیم و میانگین پارامترها را برای هر نمونه حساب می کنیم.

میانگین حاصل از روش دستگاهی ـ میانگین حاصل از روش دستی

۱۰۰ * ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ = فاکتور تصحیح

میانگین حاصل از روش دستگاهی

یک فاکتور تصحیح مثبت نشان می دهد که نتایج بدست آمده از دستگاه اتوماتیک درصدی پایین تر از روش دستی پاسخ میدهد. پس از اینکه فاکتور تصحیح برای هر کدام از ۲۰ نمونه انجام شد، میانگین این فاکتورها برای اصلاح پارامترهای مربوطه بدستگاه داده می شود.

باید توجه کرد که در روش دستی باید از ملانژور، هموسیتومتر و لامل سنگی استاندارد استفاده نمود و دقت لازم را در شمارش بکار برد.

کالیبراسیون دستگاه را مرتباً باید بطریقی بررسی نمود از جمله :

ـ استفاده از خون کنترلی (کنترلی دقت) و بررسی نتایج که باید در محدود مورد انتظار باشد.

ـ بررسی هماتوکریت جهت هماتوکریت و برای شمارش سلول سفیدو قرمز استفاده از تکرار شمارش از یک نمونه و بدست آوردن میانگین آنها.

ـ بر اساس سیستم اطمینان کیفی با استفاده از داده های بیماران بخصوص MCV, MCH, MCHC :

این پارامترها و میانگین روزانه آنها در آزمایشگاههائی که بیش از ۵۰ بیمار دارند معمولاً ثابت است، مشروط بر اینکه در روزهای بخصوص بیماران خاصی پذیرفته نشوند.

توصیه های سازمان بهداشت جهانی در مورد بررسی انگل مالاریا در گسترشهای خون محیطی

تشخیص قطعی گونه های مختلف پلاسمودیوم با استفاده از گسترشهای خونی امکان پذیر می باشد. برای تشخیص این انگل استفاده از هر دو گسترش ضخیم و نازک توصیه می شود. در مواردی که پارازیتمی کم باشد، یافتن انگل در گسترش ضخیم با سهولت بیشتری امکان پذیر بوده ولی تشخیص گونه و مرحله رشد آن در گسترش نازک بهتر است.

گسترش ضخیم با گذاشتن چند قطره خون بر روی لام و مخلوط کردن آنها با هم و ایجاد دایره ای به قطر ۲ سانتی متر تهیه می شود. در این نوع گسترش ضخامت گلبولهای قرمز بین ۶ – ۲۰ لایه می باشد. مدت زمان مخلوط کردن قطرات خون با حرکت دورانی حدود ۳۰ ثانیه بوده که این عمل از تشکیل رشته های فیبرین جلوگیری می نماید، در غیر این صورت رشته های فیبرین روی انگل ها قرار گرفته و تشخیص را مشکل یا غیرممکن می سازد. پس از تهیه گسترش باید آن را در جایی دور از گرد و خاک و دور از حرارت و رطوبت قرار داده و از مواد ثابت کننده (فیکساتیو) مانند متانل هم استفاده نکرد زیرا با این کار هموگلوبین در گلبولهای قرمز باقیمانده که مانع تشخیص می گردد. خارج کردن هموگلوبین از گسترش ضخیم، توسط آب مقطر و یا محلول رنگی که برای رنگ آمیزی گسترش بکار میرود انجام می گیرد.

در بررسی گسترش نازک اندازه گلبولها و وجود و عدم وجود دانه های شافنر از اهمیت زیادی برخوردار است. گلبول قرمز بزرگ و وجود دانه های شافنر مطرح کننده وجود پلاسمودیوم ویواکس و اووال پاروم می باشد. در عفونت پلاسمودیوم مالاریه ممکن است گلبولهای قرمز کوچکتر از معمول دیده شوند.

جهت رنگ آمیزی گسترشهای خونی حاوی انگل از رنگهای گروه رومانوفسکی استفاده می گردد که شامل گیمسا، رایت، لشمن، فیلد و غیره می باشد که بهترین و مهمترین آنها رنگ آمیزی گیمسا است. رنگ آمیزی فیلد از طرف WHO برای رنگ کردن گسترشهای ضخیم توصیه می گردد. در بررسی گسترشهای ضخیم توجه به انتها و اطراف گسترش، امکان یافتن انگل را بیشتر می کند. قبل از منفی گزارش کردن یک اسلاید ضخیم حداقل ۱۰ دقیقه مشاهده آن که معادل ۲۰۰ میدان دید با روغن است توصیه می گردد.

مواردی مانند وجود تکه هایی از گلبولهای سفید، رسوب رنگ روی گلبول قرمز، وجود باقیمانده هایی از سلولهای پوستی، پلاکتهای چسبیده به گلبول قرمز، تجمعهای پلاکتی، غبار، باکتری ، قارچ، اسپور و سایر ارگانیسمها که در حین خشک شدن روی لام قرار می گیرند، با انگل اشتباه می شوند، اگر چه عدم وجود سیتوپلاسم آبی، کروماتین قرمز یا بنفش و یا پیگمان قهوه ای یا سیاه در افتراق این موارد از انگل کمک کننده هستند.

در صورت مشاهده پلاسمودیوم فالسی پاروم درصد پارازیتمی باید قید گردد که برای تعیین آن در گسترش ضخیم تعداد پارازیتها در هر میلی متر مکعب خون به نسبت تعداد لکوسیتها شمارش می شود. تعداد ۸۰۰۰ لکوسیت در هر سانتی متر مکعب بعنوان میانگین در نظر گرفته میشود. قبل از شمارش حدود ۲۵/۰ سانتی متر مکعب خون، که حدود ۱۰۰ میدان دید با روغن در گسترش ضخیم است، بررسی شده تا گونه و مرحله رشد انگل مشخص گردد. اگر به ازای ۲۰۰ لکوسیت شمرده شده ۱۰ یا بیشتر انگل شمرده شود، تعداد پارازیتها بر حسب ۲۰۰ لکوسیت ثبت میگردد. اگر به ازای ۲۰۰ لکوسیت ۹ یا کمتر انگل مشاهده گردد باید ۵۰۰ گلبول سفید شمارش شده و تعداد پارازیتها را بر اساس تعداد ۵۰۰ لکوسیت گزارش نمود.

۸۰۰۰ * تعداد پارازیت

تعداد انگل بر حسب میکرولیتر = ــــــــــــــــــــــــــــ

تعداد گلبول سفید

آزمایشگاه خون شناسی

مرکز تحقیقات آزمایشگاههای رفرانس

Reference:

Basic Laboratory Methods In Medical Parasitology (WHO). ۱۹۹۱.

Natoinal External Quality Assurance Scheme, Parsitology Teaching Sab-Scheme (WHO). ۱۹۹۶.

http://www.hbi.ir/hosting/referance/rli/scientific/hematology.htm

NCCLS Vol. ۱۲, No. ۱۷ September ۱۹۹۲.

Department of Clinical Parasitology, Teaching Sheet, May ۱۹۹۵

Gilmer, P.R etal (۱۹۷۷) Calibration Methods for Automated Heamatology Instrument, A.J, Clin Path.

Row A.N, R.M, and England, J. M (۱۹۸۶) Automation and quality Assurance in Heamatology Oxford Blackwell.