تمایز مایکوباکتریوم توبرکولوزیس ازمایکوباکتریوم بویس با استفاده ازآنالیز شیمیایی اسیدهای مایکولیک دیواره سلولی آنها

علیرغم‌ این‌ كه‌ اكثر موارد سل‌ انسانی‌ توسط‌ مایكوباكتریوم‌ توبركولوزیس‌ صورت‌ می‌گیرد، مواردی‌ از عفونتهایی‌ كه‌ توسط‌ مایكوباكتریوم‌ بویس‌ به‌ وجود می‌آیند نیز بطور روز افزونی‌ گزارش‌ می‌گردند(۳-۱). روشهای‌ كلاسیك‌ تمایز این‌ دو گونه‌ براساس‌ تست‌ احیاء نیترات‌، فعالیت‌ پیرازین‌ آمیداز، حساسیت‌ به‌ پیرازین‌ آمید، تجمع‌ نیاسین‌ و رشد در محیط‌ حاوی‌ تیوفن‌ ۲- كربوكسیلیك‌ اسید هیدرازید است‌. بعضی‌ از این‌ روشها، مشكل‌ و وقت‌گیر هستند و به‌ ندرت‌ در آزمایشگاههای‌ تشخیصی‌ بكار برده‌ می‌شوند. با این‌ وجود، از نقطه‌ نظر كلینیكی‌، به‌ دلیل‌ مقاومت‌ M.bovis به‌ پیرازین‌ آمید و همچنین‌ اپیدمیولوژیكی‌، به‌ دلیل‌ نوع‌ اپیدمی‌هایی‌ كه‌ این‌ باكتریها در آنها درگیر می‌باشند، تمایز این‌ دو باكتری‌ از یكدیگر كاملاً لازم‌ و ضروری‌ است‌(۴).
روشهای‌ گوناگون‌ ژنتیكی‌ نیز برای‌ تمایز این‌ دو باكتری‌ استفاده‌ شده‌ است‌. بعضی‌ از این‌ روشها در دست‌ بررسی‌ می‌باشند (۴) و بعضی‌ از روشهای‌ دیگر با مشكلاتی‌ همراه‌ بوده‌ است‌. سالها قبل‌، ژن‌ mtp ۴۰ كه‌ تصور می‌شد در M.tuberculosis وجود دارد امّا در M.bovis نیست‌، شناسایی‌ و مشخص‌ گردید (۵). در ابتدا تكنیك‌ تكثیر PCR این‌ ژن‌ برای‌ تمایز مایكوباكتریوم‌ توبركولوزیس‌ از مایكوباكتریوم‌ بویس‌ بكار برده‌ شد (۶). امّا با مشخص‌ شدن‌ این‌ نكته‌ كه‌ این‌ ژن‌ در تمام‌ سویه‌های‌ مایكوباكتریوم‌ توبركولوزیس‌ وجود ندارد و همچنین‌ در بعضی‌ از سویه‌های‌ M.bovis وجود دارد، دیگر معتبر نیست‌ (۷). توالی‌ نوكلئوتیدهای‌ ژن‌ katG مایكوباكتریوم‌ بویس‌ نیز مشابه‌ مایكوباكتریوم‌ توبركولوزیس‌ است‌ با این‌ تفاوت‌ كه‌ در موقعیت‌ ۱۳۸۸ بجای‌ بازالی‌ گوانین‌، تیمین‌ قرار دارد (۸). روشهای‌ مرسوم‌ آنالیز اسیدهای‌ مایكولیك‌ دیوارة‌ سلولی‌ مایكوباكتریومها نیز كه‌ تاكنون‌ برای‌ تمایز مایكوباكتریومها بكار برده‌ می‌شود، نتایج‌ مشابهی‌ را در مورد این‌ دو باكتری‌ نشان‌ می‌دهند (۱۰ و ۹). در روشهای‌ HPLC بكار برده‌ شده‌، نكتة‌ تشخیصی‌، اسیدهای‌ مایكولیك‌ با تعداد كربنهایی‌ متوسط‌ و بالا مورد نظر بوده‌ است‌ (۱۱-۹) امّا گزارشهایی‌ نیز در مورد وجود تفاوتهایی‌ در اسیدهای‌ مایكولیك‌ كوتاه‌ زنجیره‌ وجود دارد(۱۲). در روشهای‌ فوق‌الذكر، به‌ دلیل‌ آنكه‌ توجه‌ به‌ چنین‌ اسیدهای‌ مایكولیك‌ بلند زنجیره‌ بوده‌ است‌، پروسه‌های‌ آماده‌سازی‌ و آنالیز نیز جهتی‌ به‌ این‌ سو داشته‌اند. با عنایت‌ به‌ این‌ موارد، در این‌ بررسی‌ اقدام‌ به‌ تغییر در پارامترهای‌ HPLC در جهت‌ شناسایی‌ اسیدها مایكولیك‌ كوتاه‌ زنجیره‌ نموده‌ و با توجه‌ به‌ تغییرات‌ صورت‌ گرفته‌، موفق‌ به‌ مشخص‌ كردن‌ تفاوتهای‌ قابل‌ تكراری‌ در پیكهای‌ كروماتوگرامهای‌ سویه‌های‌ مایكوباكتریوم‌ توبركولوزیس‌ و بویس‌ مورد بررسی‌ در این‌ تحقیق‌ شدیم‌.
روشها
سویه‌های‌ بكار برده‌ شدة‌ مایكوباكتریوم‌ توبركولوزیس‌، از مركز تحقیقات‌ سل‌ و بیماریهای‌ ریوی‌ بوده‌ و كلیة‌ تستهای‌ بیوشیمیایی‌ در آن‌ مركز بر روی‌ این‌ سویه‌ها صورت‌ گرفته‌ است‌. سویه‌های‌ M.bovis ، استاندارد M.bovisATCC۱۹۲۱۰ و سه‌ سویه‌ از سویه‌های‌ كشتارگاه‌ دام‌ بوده‌ كه‌ الگوی‌ HPLC مشابه‌ M.tuberculosis داشته‌اند (۱۳) امّا تست‌ نیاسین‌ و نیترات‌ آنها منفی‌ بوده‌، كند رشد و nonchromogen نیز بوده‌اند (تفكیك‌ M.tuberculosis ). اسیدهای‌ مایكولیك‌ این‌ باكتریها پس‌ از كشت‌ اوّلیه‌ بر روی‌ محیط‌ لونشتین‌- جانسون‌، صابونی‌ و استخراج‌ گردیده‌ و سپس‌ عمل‌ مشتق‌سازی‌ را به‌ این‌ صورت‌ اصلاح‌ كرده‌ و بجای‌ استونیتریل‌ به‌ همراه‌ پارابروموفناسیل‌ بروماید و تركیب‌ ۱۸ Crown ، از كلروفورم‌ به‌ همراه‌ این‌ مواد استفاده‌ نمودیم‌. به‌ این‌ ترتیب‌، چون‌ اسیدهای‌ مایكولیك‌ بلند زنجیره‌ در كلروفورم‌ بیشتر حل‌ می‌گردند، بنابراین‌، عمل‌ مشتق‌سازی‌ بر روی‌ اسیدهای‌ چرب‌ با زنجیره‌های‌ كمتر اتم‌ كربن‌ صورت‌ می‌گیرد (۱۴) بقیة‌ مراحل‌ انجام‌ آزمایش‌ مانند روشهای‌ قبل‌ بوده‌ است‌ (۱۳). به‌ همراه‌ هر نمونه‌ مقدار ۵ میكرولیتر هگزان‌ كه‌ هیچ‌ گونه‌ نگهداری‌ از آن‌ توسط‌ ستون‌ صورت‌ نمی‌گیرد و كاملاً غیر قطبی‌ است‌، به‌ ستون‌ تزریق‌ شد تا بتوان‌ زمانهای‌ بازداری‌ را نسبت‌ به‌ شرایط‌ انجام‌ HPLC نیز به‌ صورت‌ ذیل‌ تغییر داده‌ شد. از گرادیان‌ متانول‌ و دی‌ كلرومتان‌ به‌ این‌ صورت‌ استفاده‌ گردید كه‌ ابتدا غلظت‌ كلروفورم‌ ۹۸ درصد قرار داده‌ شد، سپس‌ در مدت‌ یك‌ دقیقه‌ مقدار آن‌ به‌ ۸۰ درصد تقلیل‌ داده‌ شد و در مدت‌ ۲۵ دقیقه‌ به‌ میزان‌ ۳۰ درصد رسید و در طی‌ ۲ دقیقه‌ مجدداً به‌ ۹۸ درصد افزایش‌ یافته‌ و مدت‌ ۲ دقیقه‌ در همین‌ شرایط‌ نگه‌ داشته‌ شد. سرعت‌ جریان‌ ml/min ۶/۰ بوده‌ و متانول‌ و دی‌ كلرومتان‌ مورد استفاده‌ از شركت‌ Merck و از درجة‌ HPLC بوده‌اند.
نتایج‌
نتایج‌ حاصل‌ از آماده‌ سازی‌ و تزریق‌ نمونه‌های‌ مورد بررسی‌ به‌ دستگاه‌ HPLC با شرایط‌ مذكور در بخش‌ مواد و روشها، به‌ صورت‌ كروماتوگرامهای‌ ذیل‌ حاصل‌ شده‌اند. محور افقی‌ این‌ كروماتوگرامها، زمان‌ بازداری‌ و محور عمودی‌ میزان‌ جذب‌ در nm ۲۶۰ را نشان‌ می‌دهد.
كروماتوگرام‌ ۱ مربوط‌ به‌ M.bovis است‌ و كروماتوگرام‌ ۲ مربوط‌ به‌ M.tuberculosis . همانطور كه‌ از مقایسة‌ این‌ كروماتوگرامها مشخص‌ می‌شود این‌ دو باكتری‌ در پیكهای‌ شمارة‌ ۴-۱ خود با یكدیگر اختلاف‌ دارند. این‌ اختلاف‌ به‌ صورت‌ قابل‌ تكرار در تمام‌ سویه‌های‌ مورد بررسی‌ وجود داشته‌ و در سویه‌های‌ متعلق‌ به‌ یك‌ گونه‌ تشابه‌ كامل‌ در این‌ پیكها مشاهده‌ شده‌ است‌. اختلافات‌ مربوط‌ به‌ دو گونه‌ عمدتاً به‌ اختلاف‌ در ارتفاعات‌ پیكهای‌كروماتوگرام‌ ۲. نمونه‌ پیك‌ مربوط‌ به‌ M.tuberculosis با روش‌ اصلاح‌ شده‌ HPL
كروماتوگرام‌ ۱. نمونه‌ پیك‌ مربوط‌ به‌ M.bovis با روش‌ اصلاح‌ شده‌ HPLC
سویه‌های‌ M.bovis و M.tuberculosis به‌ كار رفته‌ در این‌ تحقیق‌، اگر چه‌ الگوهای‌ مشابه‌ و قابل‌ تكراری‌ در داخل‌ هر كدام‌ از گونه‌ها مشاهده‌ می‌شود ولی‌ در بین‌ دو گونه‌ در كروماتوگرامهای‌ ۱ و ۲ اختلاف‌ قابل‌ مشاهده‌ای‌ ملاحظه‌ می‌گردد.
نتایج‌ حاصل‌ از این‌ تحقیق‌ با نتایج‌ مطالعات‌ انجام‌ شدة‌ قبلی‌ Thiebert (۹) و Floyd (۱۰) كه‌ الگوهای‌ كروماتوگرام‌ دومایكوباكتریوم‌ را مشابه‌ می‌دانستند، اختلاف‌ دارد. علت‌ این‌ تفاوت‌ ممكن‌ است‌ در نكات‌ ذیل‌ باشد كه‌ در مجموع‌ شرایط‌ حاضر
نظیر آنها (غلظت‌ هر یك‌ از مشتقات‌) برمی‌گردد و با مقایسة‌ این‌ ارتفاعات‌ با ارتفاع‌ پیك‌ مربوط‌ به‌ هگزان‌، می‌توان‌ با اختلافات‌ موجود در۳ فاكتور زمان‌ بازداری‌ نسبی‌، سطح‌ زیر منحنی‌ نسبی‌، ارتفاع‌ نسبی‌ پیكها نسبت‌ به‌ شناسایی‌ و تمایز دو مایكوباكتریوم‌ بویس‌ و توبركولوزیس‌ از یكدیگر اقدام‌ كرد(جدول‌ ۱).
بحث‌
بررسی‌ كروماتوگرامهای‌ یك‌ و دو نشان‌ می‌دهد كه‌ بین را برای‌ جداسازی‌ و تمایز این‌ دو باكتری‌ مناسبتر می‌سازد: نحوة‌ مشتق‌سازی‌ در استفاده‌ از كلروفورم‌ بجای‌ استونیتریل‌ (۱۳)؛ هدف‌ مشتق‌سازی‌ (مشتق‌سازی‌ اسیدهای‌ مایكولیك‌ كوتاه‌ زنجیره‌) (۱۳)؛ استفاده‌ از گرادیان‌ متانول‌ - دی‌ كلرومتان‌ (دی‌ كلرومتان‌ اندیس‌ قطبیت‌ كمتری‌ نسبت‌ به‌ كلروفورم‌ دارد) (۱۴)؛ تفاوت‌ در زمانها و غلظتهای‌ شستشو.
مطالعات‌ انجام‌ شده‌ توسط‌ Thiebert (۹) نیز به‌ دلیل‌ استفاده‌ از همان‌ روشهای‌ قبلی‌ (۱۳-۱۰)، محقق‌ موفق‌ به‌ یافتن‌ مقالات‌ بیشتری‌ كه‌ مرتبط‌ باموضوع‌ این‌ تحقیق‌ باشد، نشده‌است‌)، قادر به‌ تمایز مایكوباكتریومهای‌ توبركولوزیس‌ و بویس‌ نبوده‌ است‌.در استفاده‌ از GLC برای‌ شناسایی‌ مایكوباكتریومها نیز تغییر در هدف‌ جداسازی‌ (تغییر در اسیدهای‌ مایكولیك‌ با تعداد خاصی‌ از اتمهای‌ كربن‌ در این‌ اسیدها) كمك‌ به‌ تمایز و جداسازی‌ مایكوباكتریومهایی‌ كرده‌اند كه‌ با روش‌ معمولی‌ GLC كه‌ به‌ صورت‌ میكروسافتهای‌ تجارتی‌ ارائه‌ شده‌اند و آزمایشگاهها از این‌ میكروسافتهای‌ تجارتی‌ استفاده‌ می‌كنند، قابل‌ جداسازی‌ نبوده‌اند.
Bottger (۱۵) كه‌ M.genavense در روش‌ GLC با M.fortuitum را به‌ علت‌ اشتباه‌ در محدودیتهای‌ میكروسافتهای‌ تجاری‌ ارائه‌ شده‌ توسط‌ ( MIS ) Microbiol Identification System عنوان‌ می‌كند و معتقد است‌ با توجه‌ به‌ سایر فاكتورهایی‌ كه‌ مورد توجه‌ این‌ سیستم‌ در شناسایی‌ نیست‌، می‌توان‌ به‌ سهولت‌ این‌ دو باكتری‌ را از هم‌ تفكیك‌ نمود. شاید در مورد استفاده‌ از HPLC و عدم‌ توانایی‌ شناسایی‌ دو مایكوباكتریوم‌ بویس‌ و توبركولوزیس‌ نیز استفاده‌ از میكروسافتهایی‌ باشد كه‌ تكیه‌ بر اسیدهای‌ مایكولیك‌ با وزن‌ ملكولی‌ بالا (و نه‌ استفاده‌ از اسیدهای‌ مایكولیك‌ كوتاه‌ زنجیره‌) دارند.
قدردانی‌: از معاونت‌ پژوهشی‌ دانشگاه‌ علوم‌ پزشكی‌ اصفهان‌ كه‌ بودجه‌ این‌ تحقیق‌ را در اختیار پژوهشگران‌ قرار دادند تشكر و قدردانی‌ می‌گردد.

References
۱- Blazques J. Espinosa LB. et al, Genetic characterization of multidrug resistant Mycobacterium bovis strains from a hospital outbreak involving human immunodeficiency virus positive patients, J Clin Microbiol ۳۵: ۱۳۹۰-۹۳; ۱۹۹۷.
۲- Bouvet E. Casalino E. et al, A nosocomial outbreak of multidrug resistant Mycobacterium bovis among HIV infected patients: A case control study, AIDS, ۷: ۱۴۵۳-۶۰; ۱۹۹۳.
۳- Guerrero A. Cobo J. et al, The emergence of drug resistant tuberculosis in a Spanish hospital. Abstr. ۱۸۹, P: ۲۲۱, In: Program and Abstracts of the ۳۵th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. American Society for Microbiology, Washington DC, ۱۹۹۵.
۴- Espinosa Monteros LE. Galan JC. etal, Allele specific PCR method based on pncA and oxyR sequences for distinguishing Mycobacterium bovis from Mycobacterium tuberculosis: Intraspecific M.bovis pncA sequence polymorphism, J Clin Microbiol, ۳۶: ۲۳۹-۴۲; ۱۹۹۸.
۵- Parra CA. Londono LP. etal, Isolation, characterization and molecular cloning of a specific Mycobacterium tuberculosis antigen gene: Identification of a species specific sequence Infect Immun ۵۹: ۳۴۱۱-۱۷; ۱۹۹۲.
۶- Portillo DP. Murillo LA. etal, Amplification of a species Specific DNA fragment of Mycobacterium tuberculosis and its possible use in diagnosis, J Clin Microbiol, ۲۹: ۲۱۶۳-۶۸; ۱۹۹۱.
۷- Weil A. Plkaytis B B. etal, The mtp-۴۰ gene is not present in all strains of Mycobacterium tuberculosis, J Clin, Microbiol, ۳۴: ۲۳۰۹-۱۱; ۱۹۹۶.
۸- Sreevatsan S. Escalante P. Pan X. etal, Identification of a polymorphic nucleotide in oxyR specific for Mycobacterium bovis, J Clin Microbiol, ۳۴: ۲۰۰۷-۱۰; ۱۹۹۶.
۹- Thiebert L, Routin application of HPLC for identification of Mycobacteria, J Clin Microbiol, ۳۱: ۱۷۵۹-۶۳; ۱۹۹۳.
۱۰- Floyd M. Silcox V A. Jones W D. etal, Separation of Mycobacterium bovis BCG from Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by high performance liquid chromatography of Mycolic acids, J Clin Microbiol, ۳۰: ۱۳۲۷-۳۰; ۱۹۹۲.
۱۱- Butler WR. Jost KC. Kilburn JO, Identification of Mycobactenia by high Performance Liquid chromatography, J Clin Microbiol, ۲۹: ۲۴۶۸-۷۲; ۱۹۹۱.
۱۲- Mitruka BM, Gas Liquid Chromatograghy:Application in Biology and Medicine, London: Academic Press, pp: ۱۹۶-۲۲۶; ۱۹۷۵.
۱۳- Butler WR. Kiburn JO, Identification of major Slowly growing pathogenic Mycobacteria and Mycobacterium gordonae by high performance liquid chromatography of their mycolic acids, J Clin Microbiol, ۲۶: ۵۰-۳; ۱۹۸۸.
۱۴- Lindsay S, High performance liquid chromatography. NewYork: John Wiley and Sons Co, pp: ۱۱۸-۴۸; ۱۹۹۷.
۱۵- Bottger EC, Approaches for identification of microorganisms, ASM News, ۶۲(۵): ۲۴۷-۵۰; ۱۹۹۶.
۱۶- Chou S. Kasatiya S, Misidentification by GLC, ASM ews, ۶۳(۳): ۱۲۱-۲۲; ۱۹۹۷

دكترسید اصغر هوائی- دكتر تقی ناصرپورفریور- دكتر حسن تمیزیفر- دكترغلآامعلی نادری
استادیار گروه باكتری و ویروس شناسی دانشكده پزشكی دانشگاه علوم پزشكی و خدمات بهداشتی - درمانی استان اصفهان گروه باكتری و ویروس شناسی دانشكده پزشكی دانشگاهعلومپزشكیوخدماتبهداشتی-درمانیاستانسیستانوبلوچستان استادیار گروه باكتری و ویروس شناسی دانشكده پزشكی دانشگاه علوم پزشكی و خدمات بهداشتی - درمانی استان اصفهان استادیار مركز تحقیقات قلب و عروق دانشگاه علوم پزشكی و خدمات بهداشتی - درمانی استان اصفهان

منبع : پایگاه جامع اطلاع رسانی پزشکان ایران