استراتژی‌ها و روش‌های انتقال ژن در طیور

۱) انتقال ژن به وسیله اسپرماتوزوئیدها:
در ابتدای پیشرفت تکنیک‌های ترانس ژنیک به نظر می‌رسید که تنها اسپرماتوزوئیدها ابزار مناسب وراثت برای انتقال یک قطعه ژنتیکی خارجی به ژنوم حیوانات می‌باشند. Bracket و همکارانش در سال ۱۹۷۱ ثابت کردند که اسپرماتورزوئیدهای پستانداران قادرند که به DNA خارجی متصل شده و آن را در طی فرآیند باروری و لقاح به تخمک‌ ماده‌ها منتقل کنند. عملکرد این روش در سال ۱۹۸۷ نیز برای طیور پیشنهاد شد. به طور کلی یک قطعه DNA به اسپرم باند می شود و این اسپر برای تلقیح ماده‌ها به کار می‌رود و اسپرمی که تخمک را بارور می‌کند، حاوی ژن مورد نظر است که آن را به تخمک منتقل می کند و در نهایت آن ژن در جوجه‌های هچ شده بروز پیدا می کند. اخیراً این روش در تولید پستانداران ترانس ژنتیک به کار می رود، اما هنوز اطلاعات قانع کننده ای از این که انتقال ژن با واسطه اسپرم می تواند به طور موفقیت آمیزی، ترانس ژن را به Germline منتقل کند در دسترس نیست .
(mazaziak et al, ۲۰۰۴).
۲) روش ریز تزریق DNA :
در این روش DNA را به کمک میکروپیپت به درون هسته سلول ها می فرستند. این DNA احتمال ادغام با ژنوم سلول میزبان را خواهد داشت. این روش یک روش عمومی برای معرفی ژن‌های خارجی به پستانداران می‌باشد، که اغلب انتقال DNA به پیش هسته تخمک تازه بارور شده صورت می‌گیرد. اما استفاده از این تکنیک برای تزریق DNA به تخم پرندگان د مقایسه با پستانداران بسیار مشکل‌تر است. زیرا یک تخم تازه گذاشته شده مرغ شامل حدوداً ۰۰۰/۶۰ – ۰۰۰/۵۰ سلول است. بنابراین ریز تزریق DNA به طور گسترده برای تخم مرغ های تازه به کار نمی‌رود.
اما روی رویان تازه بارور شده مرغ بعد از کشتن و جمع آوری تخم ها انجام می شود. تخم‌های ریز تزریق شده برای هچ به محیط کشت سه مرحله‌ای Exovo منتقل می شوند
.(mazaziak et al, ۲۰۰۴; Love et al, ۱۹۹۴; Sherman, ۱۹۹۸)
۳) انتقال ژن به کمک رترو ویروس‌ها:
ناقل‌های رتروویروس‌ یکی از ناقل‌های عمومی در انتقال ژن می‌باشند و می‌توانند ژن‌های خارجی را به germliae طیور انتقال دهند. تکنیک های انتقال ژن با استفاده از رتروویروس‌ها به کرات برای ایجاد مرغ‌های ترانس ژنیک به کار رفته است. زیرا تیترهای بالای رترویروس ها امکان انتقال مورد نظر را به سلول های زیادی دارا است. به طور کلی رترورویروس ها شامل یک ژنوم از نوع RNA می‌باشند که یک هسته پروتئینی که حاوی آنزیم Integrase می‌باشد، قرار دارد.
پوشش پروتئینی ویروس به گیرنده های ویژه روی سلول میزبان متصل می‌شود. سپس اجزاء ویروس به وسیله میانجیگری گیرنده ها با استفاده از اندوستیوز به داخل سیتوپلاسم میزبان وارد می‌شود. RNA ویروسی به CDNA که می تواند به داخل هسته منتقل شود، کپی می‌شود و CDNA با DNA سلول میزبان یکپارچه می شود (با استفاده از Integrase ).
این DNA متصل شده به DNA میزبان، به همراه سلول میزبان همانندسازی انجام میدهد و توارث آن نیز بر اساس ژنتیک مندلی صورت می گیرد.
DNA ویروسی الحاق یافته به ژنوم میزبان می تواند یک RNA ویروسی برای سنتز و پروتئین‌هایی که شامل یک پلیمراز (pol) و (gag) و پروتئین های غشایی یا بسته بندی کننده (Env) ایجاد می‌کند. این سه دسته پروتئین یک پوشش ویروسی جدید ایجاد می‌کند و RNA ژنوم ویروسی را داخل آن بسته بندی ‌کند. این کمپلکس جدید به غشاء سلول میزبان منتقل می‌شود و به خارج سلول هدایت می‌شود.
در انواع وکتورهایی که توانایی تکثیر دارنده ژن‌های ساختمانی و توالی های بسته بندی کننده (Packaging) سالم و کامل هستند تا توانایی ادامه تولید ذرات ویروسی را داشته باشند که می توانند دیگر سلول‌ها را آلوده کنند. بنابراین وکتورهای رتروویروسی که قادر به تکثیر هستند به آسانی قادر به آلوده‌سازی تعداد کافی از سلول‌های زاینده و انتقال ژن مورد نظر به دومین و متعاقباً نسل‌های بعد را دارا است. اما در ایجاد طیور ترانس ژنیک با استفاده از رتروویروس‌هایی که توانایی تکثیر را دارند، قادر خواهند بود که دائماً ویورس را به محیط آزاد کنند. (در اصطلاحبه آنها shedder گفته می شود) .این امر وضعیت قابل قبولی نیست.
اما ناقل‌های رتروویروسی که توانایی تکثیر ندارند (Replication – Defective – Retroviruses) ، به این علت که ژن‌های pol یا gag یا env را که برای تکثیر لازم است، ندارند، ذرات جدید ویروس هایی ناقص هستند و آلودگی محیطی را کاهش می دهند. ناقل هایی که توانایی تکثیر ندارند، استعداد آلوده سازی سلول های میزبان را دارند، ولی توانایی ایجاد ذرات جدید ویروسی را ندارند.
رتروویروس‌های ناقص یعنی آن هایی که توانایی تکثیر ندارند، توانایی انتقال ژن های خارجی با تعداد بازهای بیش از kb۱۰ را دارند. زیرا آن ها بعضی از ژن های ضروری برای همانند سازی خود را از دست داده اند. ناقل های رتروویروسی جدید متکامل تر شده اند و بر پایه استراتژی‌های جدید حداقل آلودگی را ایجاد می‌کند. (silter, ۱۹۸۶,۱۹۸۷; Bosselman et al, Cosset, ۱۹۹۰; Thoraval, ۱۹۹۵)
۴) انتقال مستقیم DNA به بیضه ها:
این روش در سال ۱۹۹۵ توسط مارشال گزارش شد. در این روش پتانسیل انتقال مستقیم DNA خارجی به بافت بیضه پایین است و از عوامل محدود کننده آن به شمار می رود.(mazaziak et al, ۲۰۰۴)
۵) انتقال ژن به کمک سلول های بلاستومری:
سلول‌های بلاستومری در کارهای ترانس ژنتیکی بسیارمفیدند، آن ها به راحتی از حیوان دهنده به حیوان گیرنده منتقل می شوند و به راحتی در تشکیل بافت‌های سوماتیک و بافت های جنسی یا germline شرکت می‌کنند.
در محیط کشت چندین روز قابل نگهداری هستند و می توان بیان ژن های انتقال یافته را در آن ها قبل از انتقال به جنین در آزمایشگاه بررسی کرد. این ویژگی های آن ها باعث می‌شود که این سلول‌ها ناقل‌های ایده‌آلی برای تغییرات ژنتیکی جدید در germline باشند.
در این تکنیک سلول ها استخراج می شوند. دستکاری می شوند و در نهایت در داخل یک رویان در حال رشد قرار می گیرند. با این هدف که یک جنین آمیخته (Chimeric) ایجاد شود که در germline آن، ژن مورد نظر وجود دارد. در نهایت ایجاد نتاج G۰ که این نتاج با همدیگر آمیزش پیدا می‌کنند تا مرغ‌های G۱ را ایجاد کنند که ترانس ژن را با خود حمل می‌نمایند .(Kamihira et al, ۲۰۰۴) .
۶) انتقال ژن به کمک سلول‌های PGC (primordial germ cells).
از زمانی که سلول‌های PGC به عنوان سلول‌های پایه در تولید اسپرماتوزوآ و یا تخمک شناخته شدند، استفاده از آن ها روش مفیدی در تولید طیوری ترانس ژنتیک می‌باشد.
سلول‌های PGC (سلول‌های جنینی اولیه) منشأ germline در جنس طیور هستند، این سلول‌ها در مراحل ابتدایی تمایز جنینی (مرحله دهم) شروع به تمایز می کنند و در یک منطقه خارج جنین که به هلال زاینده (Germ crescent) منتهی می شود ، قابل استخراج اند.
این سلول‌ها از هلال زاینده به برآمدگی گنادی در جنین (Gonadol ridge) توسط دو مکانیسم مهاجرت می کنند و در نهایت در ساختار germline شرکت می کنند.
▪ به طور غیر فعال در یک گردش درون – خارج جنینی
(intra – extra embryonic circulation)
▪ به طور فعال با به وجود آمدن خون و جریان خون این سلول ها را به اپیتلیوم لایه ی زاینده مهاجرت می کنند.
مقصد نهایی هرتغییری در ژنوم طیور سلول زاینده (germline) است. به این علت که این سلول‌ها سرانجام ژن انتقال یافته را به نسل‌های بعدی منتقل خواهند کرد.
سلول‌های PGC مرغ می توانند در خارج ازبدن در یک محیط کامل از عوامل رشد، تکثیر یافته و بعد از انتقال ژن به آن ها در تولید طیور ترانس ژنتیک استفاده شدند.
تزریق سلول های PGC ورتروویروس‌ها و سلول‌های بلاستومری به صفحه زاینده در جنس مرغ در یک تخم تازه بارور شده صورت می‌گیرد. با این امید که این سلول های تزریق شده در germline جنین قرار گرفته ویک مرغ ترانس ژنیک ایجاد شود که بتواند ژن را به نسل های بعدی منتقل کند.
به طور کلی انتقال ژن با استفاده از رتروویروس‌ها و سلول‌های PGC از روش‌های عملی و مرسوم در انتقال ژن به ژنوم طیور می‌باشد (Mazaziak et al, ۲۰۰۴).
مشکل ترین مرحله در ایجاد طیور ترانس ژنیک انتقال ژن است. موقعی که پرنده های G۰ هچ می‌شوند ایجاد لاین از آن ها در مقایسه با انتقال ژن کار خیلی جزئی و ساده‌ای است.

مرضیه غفاری ، کارشناس ارشد تغذیه طیور

منبع : سایت علمی خبری دام و طیور