نانوذرات در تشخیص های بالینی مولکول های زیستی DNA و پروتئین در بیماری ها

استفاده از نانوذرات به عنوان نشانگر در تشخیص های مولکولی به جای نشانگرهای فعلی از جمله نشانگرهای فلورسنت, باعث افزایش حساسیت, قابلیت انتخاب و ظرفیت چندبعدی گردیده است

استفاده از نانوذرات به عنوان نشانگر در تشخیص‌های مولکولی به جای نشانگرهای فعلی از جمله نشانگرهای فلورسنت، باعث افزایش حساسیت، قابلیت انتخاب و ظرفیت چندبعدی گردیده است. روش‌‌های بر پایه این نانوذرات، نسبت به روش‌های رایج تشخیص مولکولی مزایای زیادی دارند. این مقاله مروری، بر آخرین پیشرفت‌ها در زمینه استفاده از نانوذرات به عنوان نشانگر، به ویژه در بیوحسگرها، برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌هاست.

● مقدمه

روش‌های رایج تشخیصی DNA، بر پایه PCR و استفاده از مولکول‌های فلوروفور معدنی به عنوان نشانگر استوار است. این روش‌ها بنا به دلایلی از جمله طیف‌های جذبی و نشری وسیع و تجزیه ناهمگون مولکول‌های فلوروفور معدنی، دقت تشخیص بالایی ندارند. همچنین نیازمند تجهیزات پرهزینه و پیچیده هستند [۱و۲].امروزه روش‌های رایج تشخیص پروتئین‌ها عمدتابر اساس استفاده از ELISA طراحی شده است. در این جا با وجود مشکلاتی مشابه حالت قبل علاوه بر نیاز به تجهیزات زیاد برای تکثیر پروتئین‌هایی که در مقادیر کم هستند، یافتن روشی که با روش‌های معمولی مثل ELISA امکان پذیر نیست، ضروری است [۱و۲].

در طول دهه گذشته پیشرفت‌های زیادی در استفاده از روش‌های نانو جهت تشخیص مولکولی حاصل شده است و تلاش‌ها بیشتر در جهت طراحی بیوحسگرها (Biosensors) برای تشخیص دقیق، حساس، انتخابی و کاربردی مولکول‌های زیستی می‌باشد [۳]. امروزه در بیوحسگرها برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها، به طور وسیعی از نانوذرات استفاده می‌شود. این ذرات به‌دلیل دارا بودن اندازه نانو و خصوصیات فیزیک وشیمیایی قابل تغییر و تنظیم (از جمله خواص الکتریکی، الکتروشیمیایی، نوری و مغناطیسی)، کاندیدای خوبی برای جایگزینی با دیگر مولکول‌های رنگی رایج به عنوان نشانگر در تشخیص مولکولی هستند [۱و۳و۴ ]. نانوذرات در نقش نشانگر ،حساسیت، سرعت و انعطاف‌پذیری تست‌های بیولوژیکی را جهت اندازه‌گیری حضور یا فعالیت مواد افزایش می‌دهند. از طرفی، چون در استفاده از این ذرات حجم کوچکی از نمونه نیاز است، برخی از روش‌های طراحی شده بر پایه نانوذرات، نیاز اولیه نمونه به تکثیر ماده مورد اندازه‌گیری را از جمله PCR برطرف می‌کند. امتیاز دیگر نانوذرات داشتن کارآیی تشخیص میکروارگانیسم‌ها، بافت‌های سرطانی و غیره را هم در شرایط داخل بدن (in vivo) و هم در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) دارا می‌باشند [۱و۲و۳ ].در اینجا از میان انواع نانودراتی که تاکنون طراحی و مطالعه شده است، چهار نوع نانوذره مهم که به عنوان نشانگر در تشخیص مولکولی (DNA و پروتئین) کاربرد دارند، بررسی خواهد شد. اساس تقسیم‌بندی این ذرات بر اساس سازوکار بازخوانی (Readaut)آنهاست.

● نانوذرات طلا

اندازهاین ذرات سه تا صد نانومتر بوده و به دلیل اینکه روش‌‌های اندازه‌گیری متعددی همچون جذب نوری، فلورسانس، پخش رامان، نیروی مغناطیسی و جریان الکتریکی می‌توانند برای تشخیص آنها به کار روند، نشانگرهای خوبی در طراحی بیوحسگرها می‌باشند. از این ذرات در تشخیص DNA ، پروتئین، میکروارگانیسم‌ها و غیره استفاده می‌شود. تشخیص DNA با استفاده از نانوذرات طلا نسبت به سیستم‌های تشخیص ژنومی رایج ده برابر حساسیت و صدهزار برابر ویژگی بیشتری دارد [۱و۳و۵].

▪ روش‌هایی که در آنها بازخوانی، به روش نورسنجی (Optical) صورت می‌گیرد

از خصوصیات نوری و دمایی پروب‌‌های نانوذرات طلای جدا از هم و مجتمع، (aggregated) به عنوان یک روش تشخیص استفاده می‌گردد. میان‌کنشِ ویژه موجود در بین اولیگونوکلئوتیدهای تثبیت شده (DNA Probe) روی نانوذرات طلا و DNA هدف (DNA target) باعث تجمع (assembly) نانوذرات طلا به شکل شبکه‌ای متصل به هم و در نتیجه تغییر رنگ می‌شود. این تغییر رنگ به‌واسطه خصوصیات پخش، میان‌کنشِ بین پلاسمون‌های سطح ذره و تغییر فاصله بین نانوذرات طلا ایجاد می‌گردد. این تغییر رنگ نشان‌دهنده وجود مولکول هدف در نمونه بوده و به روش چشمی هم قابل مشاهده است. این شبکه متشکل از تجمع نانوذرات به‌وسیله هیبریدشدن پروب‌های نانوذرات طلا با مولکول هدف، در درجه حرارت‌های مختلف، باعث ایجاد تغییر رنگ ناگهانی (sharp) می‌شود [۱و۵].

با انتقال مخلوطی از مجتمعات ایجاد شده بین DNA تثبیت شده، زنجیره مکمل آن و رشته‌هایی با درجات متفاوتی از تغییر توالی (نسبت به زنجیره مکمل) بر روی TLC در دماهای مختلف، می‌توان الگوی استانداردی برای ارزیابی میزان هیبرید شدن در دماهای مختلف به دست آورد. با استفاده از این خصوصیات رنگ و دما می‌توان به روشی برای تشخیص وجود جهش در DNA هدف موجود در نمونه مورد بررسی، پی ‌برد. به عبارت دیگر از این روش می‌توان برای تشخیص SNPs و دیگر mismatchs استفاده کرد [۱و۵].

حساسیت تشخیص روش‌های رنگ‌سنجی با احیای نقره (Ag) به وسیله نانوذرات طلا افزایش می‌یابد. روش روبش‌گری (Scannometry)، یک روش سنجش ساندویچی و شامل رشته DNA متصل به یک بستر

(یا DNA Chip)، یک توالی هدف و یک پروب نانوطلاست. اتصال مولکول‌های هدف و پروب نانوطلا به توالی متصل به بستر، یک‌سری لکه‌های خاکستری (gray spot) را ایجاد می‌کند که ویژه مولکول هدف بوده و غلظت نمونه را نیز نشان می‌دهد. شدت رنگ این لکه‌ها با یک روبش‌گر (scanner) و یا حتی چشم غیر مسلح، قابل تشخیص است. در صورت استفاده از نقره، با احیای آن روی نانوذرات طلا، می‌توان حساسیت تشخیص را بالا برد [۵ و۶]. با استفاده از نانوذرات مختلف طلا (و در نتیجه رنگ‌های مختلف) تشخیص همزمان چندین مولکول هدف میسر می‌گردد. این روش تشخیص مولکولی چهار برابر ویژگی بالاتر و صد برابرحساسیت بیشتر از روش‌های فلوریمتری رایج دارد[۶].

یک مثال برای این روش، بارکد زیستی (Bio-barcode) است. بارکد زیستی، یک توالی DNA ساختگی و انتخابی برای یک توالی DNA هدف است که از آن برای تشخیص DNA یا پروتئین در نمونه‌های بیولوژیک استفاده می‌شود.

الف) تشخیص DNA

در این روش ابتدا یک زنجیره DNA با توالی دلخواه (Bar- Code DNA) طراحی و رشته مکمل آن نیز ساخته و پس از فعال شدن، بر روی نانوذرات طلا نشانده می‌شود. همچنین رشته DNA دیگری که مکمل بخشی از DNA هدف (آنچه قرار است در نمونه شناسایی شود) است، پس از فعال شدن بر روی نانوذره طلا تثبیت می‌شود. سپس اجازه هیبرید شدن رشته بار -کد با DNA مکمل داده می‌شود. از طرفی رشته سوم DNA که مکمل بخش دیگری از DNA هدف است، پس از فعال شدن بر روی ذرات مغناطیسی تثبیت می‌شود. با قرار گرفتن این دو ذره در محلول، اگر DNA هدف وجود داشته باشد، حتی در مقادیر بسیار اندک، موجب اتصال این دو ذره به یکدیگر می‌شود. در مرحله بعد با توجه به خاصیت مغناطیسی ذره دوم، می‌توان آنها را از محلول جدا کرد و بعد با استفاده از عواملی (مثل ترکیبات دناتوره‌کننده) که دو رشته DNA را جدا می‌کنند، DNA بار-کد را از مکمل آن جدا و شناسایی کرد. حتی می‌توان از ترکیباتی مثل نقره که حساسیت تشخیص را بالا می‌برند نیز استفاده کرد. به این ترتیب مقادیر بسیار اندک از یک توالی DNA بدون نیاز به PCR قابل شناسایی و حتی اندازه‌گیری است [ ۷].

ب) تشخیص یا اندازه‌گیری پروتئین با استفاده از Bar- Code DNA

در این روش نیز همانند روش قبل، از یک توالی انتخابی و مکمل آن که بر روی نانوذرات طلا نشانده شده، استفاده می‌شود. همچنین آنتی بادی پلی کلونال علیه پروتئین مورد اندازه‌گیری بر روی این ذرات طلا تثبیت می‌شود. این آنتی‌بادی‌ها بر روی ذرات مغناطیسی نیز نشانده می‌شود. حال با وارد کردن این دو ذره در محلول حاوی پروتئین مورد نظر، پروتئین به آنتی‌بادی موجود در سطح هر دو ذره متصل شده و آنها را به یکدیگر متصل می‌کند. پس از شستشو و حذف سایر مواد، با توجه به خاصیت مغناطیسی ذره دوم، می‌توان آن را از محلول جدا و همانند روش قبلی، پس از جدا کردن رشته DNA بار-کد از مکمل آن با استفاده از مواد دناتوره‌کننده DNA بار- کد را، که نمادی از حضور پروتئین مورد نظر در نمونه است شناسایی و انداره‌گیری کرد [ ۸]. به این ترتیب مقادیر بسیار اندک پروتئین در نمونه قابل شناسایی است.

آخرین بحث مربوط به بازخوانی نوری نانوذرات طلا، ترکیب نانوذرات طلا با رنگ‌های رامان است که پخش رامان به وسیله نانوذرات طلا (SERS) را افزایش می‌دهد و به افزایش سیگنال برای مولکول‌های جذب شده در سطوح زبر فلز، به ویژه نقره و طلا مربوط می‌شود. این افزایش سیگنال از طریق دو ساز و کار تقویت موضعی میدان الکترومغناطیسی در الکترون آزاد فلز و اثر شیمیایی روی مولکول جذب شده در سطح فلز به‌وسیله نانوذرات طلا صورت می‌گیرد. محدوده تشخیص، در محدوده طیف رامان بوده و به‌صورت اثر انگشت‌های طیف رامان ظاهر می‌گردند. رنگ‌های رامان به‌دلیل باندهای جذبی باریک، تهییج از سوی لیزر و محدوده طیف رامان، قادر به افزایش سیگنال تشخیص در محدوده طیف‌های رامان می‌گردند. با این روش محدودیت لکه‌های خاکستری حاصل از روش روبشی(Scanometric) بر طرف شده، استفاده همزمان از چندین رنگ رامان در تشخیص چند مولکول امکان‌پذیر می‌گردد [۵ و۶]. نانوذرات طلا همچنین به عنوان داربست (Scafold) و فرونشاننده‌های quenchers نشر فلورسانس در تشخیص همگن اسیدهای نوکلئیک عمل می‌کنند [۱]. قطعات الیگونوکلئوتید به یک ترکیب دارای نشر فلورسانس (فلوروفور) متصل می‌شوند. سپس این رشته‌ها به نانوذرات طلا متصل می‌گردند، به طوری که به‌صورت تک‌زنجیره به ذره طلا نزدیک شده و نشر نداشته‌باشند. پس از اینکه این ذره در محلول حاوی DNA هدف قرار گرفت، در صورت تشکیل هیبرید، دو ماده فلوروفور از یکدیگر فاصله گرفته، نشر فلورسانس قابل مشاهده و آنالیز می‌شود.

▪ تشخیص الکتریکی مولکول‌های زیستی با استفاده از نانوذرات طلا

یکی از روش‌های ساده شناسایی DNA هدف، تشخیص الکتریکی است. در این روش پروب‌های DNA روی صفحاتی با اندازه میکرون (chip) در بین دو الکترود، تثبیت می‌گردد. این پروب‌ها طوری طراحی می‌شود که مکمل نیمی از DNA هدف باشد. همچنین طراحی پروب‌های نانوطلا به گونه‌ای است که الیگونوکلئوتید آن مکمل نیمی دیگر از DNA هدف باشد. هیبرید شدن DNA هدف با پروب‌های نانوطلا و پروب تثبیت‌شده بر روی سطح، باعث می‌شود که نانوذرات طلا در حدفاصل بین دو الکترود قرار گیرند. با افزودن نقره، کمپلکس تشکیل شده بین دو الکترود، فلز نقره را به داخل کشیده و پلی بین دو الکترود ایجاد می‌شود. از تغییر جریان حاصل می‌توان برای تشخیص حضور DNA هدف، استفاده کرد. دقت این روش در حد ۵۰۰ فمتو است و از آن در سنجش‌های ایمنی نیز استفاده می‌گردد [ ۵ و۹].

▪ تشخیص مولکول‌های زیستی با استفاده از خواص الکتروشیمیایی نانوذرات طلا

خاصیت احیاکنندگی نانوذرات طلا باعث شده است که از آنها به عنوان نشان‌های الکتروشیمیایی در تشخیص اسید نوکلئیک استفاده گردد. هیبرید شدن DNA هدف روی الکترود تثبیت شده با پروب‌های نانوطلا یک موج اکسایش طلا در حدود ۲۷/۱ ولت ایجاد می‌کند. تشخیص حضور یک جهش منفرد یا پلی‌مورفیسم تک بازی (SNP)، همچنین شناسایی بازهای درگیر، با استفاده از نوکلئوتیدهای نشاندار با نانوذرات طلا امکان‌پذیر می‌گردد [۱ و ۵]. ابتدا الیگونوکلئوتید مکمل با DNA هدف بر سطح الکترود تثبیت می‌شود. آن‌گاه محلول بیولوژیک حاوی DNA هدف به آن اضافه و هیبرید تشکیل می‌شود. اگر نمونه حاوی DNA دارای حتی یک جهش نیز باشد، چون تشکیل پیوند هیدروژنی در آن ناحیه صورت نمی‌گیرد، در ناحیه جهش، باز (ها) آزاد است. حال ، نانوذرات طلای متصل به تک تک نوکلئوتیدها، مرحله به مرحله به این نمونه ، افزوده می‌شود. در صورت اتصال نوکلئوتید متصل به نانوذره طلا به باز مکمل (که نشانگر وجود جهش در DNA هدف است) ، موج اکسایش طلا به طریق الکتروشیمیایی قابل مشاهده و اندازه‌گیری است.

● برهنه‌سازی الکتروشیمیایی (Stripping voltametry)

یک پروتکل اندازه‌گیری الکتروشیمیایی حساس است که در اندازه گیری آثار عناصر فلزی در مایعات زیستی (خون، ادرار، بزاق)، بافت‌ها (دندان و مو)، فراورده‌های غذایی (نوشابه‌ها وآب) و نمونه‌های زیستی (آب دریا و رودها) کاربرد دارد. آنالیزهای بر پایه برهنه‌سازی الکتروشیمیایی از دو مرحله پیش‌تغلیظ، سپس برهنه‌سازی تشکیل شده است. در مرحله پیش‌تغلیظ، نمونه محلول در حجم کوچکی از الکترود قرار می گیرد که در حقیقت برای بررسی محلول‌های tracer به کار می‌رود. در محلول پیش‌تغلیظ Electrodeposition انجام می‌شود که آنالیت با انجام واکنش از محلول به داخل الکترود تغلیظ می‌شود و پس از این مرحله، مرحله برهنه‌سازی با استفاده از روش ولتامتری انجام می‌شود که طی آن آنالیت تغلیظ شده با انجام واکنش عکس مجدداً حل و اندازه‌گیری می‌شود. به‌دلیل تغلیظ نمونه با فاکتور صد تا هزار برابر در الکترود، جریان اندازه‌گیری شده کمتر تحت تأثیر جریان خازنی یا جریان باقی‌مانده ناخالصی قرار می‌گیرد. تقویت سیگنال، با استفاده از سوارکردن چندین نانوذره طلا، سپس نانوذرات نقره بر روی یک بستر پلیمری به دست می‌آید. نانوذرات بعداً می‌توانند به طور آنزیمی حل و به‌وسیله برهنه‌سازی الکتروشیمیایی اندازه‌گیری شوند. از این روش در تشخیص پروتئین و DNA استفاده می‌گردد[۱ و ۵]. ابتدا یک آنتی‌بادی پیگردی روی یک ذره مغناطیسی قرار می‌گیرد که به آنتی‌ژن هدف می‌چسبد. آنتی بادی تشخیصی که روی نانوذره طلا سوار شده است اضافه می‌شود، سپس نانوذره نقره افزوده می‌شود. نانوذره طلا باعث احیای نانوذره نقره می‌گردد. کمپلکس نانوذرات و Ag-Ab روی یک مگنت قرار گرفته و نانوذرات روی الکترودها تغلیظ می‌شوند. با اعمال پتانسیل، نانوذرات رسوب‌کرده جدا شده و به روش برهنه‌سازی الکتروشیمیایی تشخیص و اندازه‌گیری می‌شوند که تغییر جریان با غلظت نمونه برابر است.

● نقاط یا ذرات کوانتومی

نانوکریستال‌های مواد نیمه‌رسانا از قبیل سلنید و کادمیم، نانوابزار دیگری برای تشخیص آزمایشگاهی محسوب می‌شود. این کریستال‌های نیمه‌رسانا به عنوان منابع نور مولکولی عمل می‌کنند و خصوصیات آنها به اندازه و شکل شان وابسته است. به محض اتصال یک آنتی‌بادی یا دیگر مواد تثبیت‌شده روی ذرات کوانتومی به مولکول هدف مورد نظر، نقاط کوانتومی شبیه beacon در اثر عمل اتصال، نور ساطع می‌کنند. امروزه ذرات کوانتومی به دلایلی از قبیل نشر وابسته به اندازه ذره، درخشان‌تر بودن، تجزیه نشدن در برابر نور، تهییج همزمان چندین رنگ، تهییج ساده و حساسیت بالا مورد توجه قرار گرفته‌اند [۱۰ و ۱۱].

▪ تولید پروب‌های نقاط کوانتومی

سنتز: این نقاط یا ذرات عمدتاً از صدها تا هزاران اتم عناصر گروه دو و شش جدول تناوبی (مثل CdTe وCdSe) و یا عناصر گروه سه و پنج (مثل InP و InAs) به‌صورت دوفازی یا سه‌فازی تهیه می‌گردند که این سیستم دوعنصری موجب ایجاد حالت نیمه‌رسانایی این ترکیبات می‌شود. ذرات کوانتومی از یک هسته (core) نیمه‌رسانای فلورسانس (مثل CdSe، CdTe، InP و یا InAs) و یک پوسته ظریف از یک ماده با باند انرژی بیشتر (مثل CdS، ZnS و یا ZnSe) تشکیل شده‌اند. این پوسته باعث پایداری هسته در برابر نور شده، از خاموشی سطحی تهییجات جلوگیری می‌کند و در نتیجه بازدهی کوانتوم را افزایش می‌دهد [۱۰ و ۱۱]. حلال‌های آلی از قبیل تری- ان- اکتیل فسفین (TOPO ) و هیدروکسیل آمین جهت حفظ خصوصیات نوری ذرات کوانتومی و محافظت هسته از محیط اطراف به عنوان پوشش (cap) به کار می‌روند. ترکیباتی مثل پلی‌اتیلن گلیکول (PEG) یا گروه‌های کربوکسیلات باعث حل‌شوندگی این ترکیبات می‌گردند. مرحله آخر تولید این ذرات، مزدوج کردن (کنژوگاسیون) آنها به لیگاندهای بیولوژیک از قبیل پپتیدها و اولیگونوکلئوتیدها برای اتصال به ترکیبات هدف است که این کنژوگاسیون می‌تواند به اشکال مختلف از جمله اتصال کوالانی، اتصال قطعه آنتی‌بادی به ذرات کوانتومی از طریق آمین سولفیدریل، کنژوگاسیون آنتی‌بادی‌ها به ذرات کوانتومی از طریق پروتئین آداپتور و اتصال پپتیدهای منتهی به هیستیدین و پروتئین‌ها به ذرات کوانتومی حاوی Ni-NTA باشد[۱۰ ].

لازم به توضیح است که ذرات کوانتومی زمانی نور را جذب می‌کنند که انرژی برانگیختن بیشتر ازانرژی Bandgap باشد. در طول این فرایند الکترون‌ها از لایه ظرفیت به لایه هدایت منتقل می‌شوند. نشر وابسته به ذرات کوانتومی به شیوه on-off عمل می‌کند که وابسته به قدرت برانگیختگی است و این پدیده احتمالاً از فوتویونیزاسیون و خنثی شدن بار نانوکریستال‌ها ناشی می‌شود[۱۱].

نانوذرات کوانتومی به دلایل مذکور کاربردهای وسیعی پیدا کرده‌اند که از جمله این کاربردها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد[۳]: Immunohistochemistry، تشخیص و تعیین ژنومی، تشخیص مارکرهای زیستی، تشخیص اولیه سرطان، تشخیص میکروارگانیسم‌های عفونی مثل مالاریا و HIV، سنجش‌های خون کامل، تشخیص حساس RNA ویروسی در حد صد کپی، سنجش‌های ایمنی و تصویرسازی از بافت زنده و... .

▪ تشخیص نوری مولکول‌ها به سیله ذرات کوانتومی

ذرات کوانتومی به‌دلیل داشتن ضریب جذب مولی بالا بسیار درخشان‌تر از سایر مولکول‌های فلوروفور هستند، ‏همچنین به‌دلیل داشتن پایداری بیشتر در مقابل نور، طیف جذبی وسیع و نشری باریک، کاندیدای خوبی جهت تشخیص ‏مولکول‌ها در شرایط ‏in‏ ‏vivo‏ محسوب می‌شوند. از این خصوصیات نوری ذرات کوانتومی در شرایط ‏in‏ ‏vivo‏ برای ‏تشخیص گیرنده‌های سطح سلولی، اجزای اسکلت سلولی و آنتی‌ژن‌های هسته‌ای در نمونه‌های مختلف شامل سلول‌های ‏زنده، سلول‌های تثبیت‌شده و برش‌های بافتی استفاده می‌شود[۱و۳ و۱۰و۱۱و۱۲].[ ۱]. ‏

▪ تشخیص مولکولی بر پایه خصوصیات الکتروشیمیایی ذرات کوانتومی

ذرات کوانتومی دارای خصوصیات احیاکنندگی هستند. از ذرات کوانتومی با پتانسیل‌های اکسیداسیون مختلف جهت تشخیص همزمان چندین مولکول هدف استفاده می‌گردد[۱,۱۱].

● نانوذرات مغناطیسی

پروب‌های نانوذرات مغناطیسی یک کلاس جدید از عوامل کنتراست و پیگردی (tracking) جهت تصویرسازی پزشکی هستند [ ۱۳و۱۴]. ساختمان این ذرات شامل یک هسته (حاوی ترکیباتی مثل اکسید آهن اَبَرپارامغناطیس (SPIO)، نیکل و یا کبالت) بوده که امروزه بیشتر از SPIOs به‌دلیل نداشتن خاصیت سمی استفاده می‌شود. در ساختمان این نانوذرات پوششی (coating) از دکستران یا پلی اتیلن گلیکول نیز وجود دارد که از تجمع (aggregation) این نانوذرات جلوگیری و باعث حل شوندگی آنها در آب و آماده شدنشان برای کونژوگه شدن می‌شود. نانوذرات با SPIOs، بنا به دلایلی از جمله غیر سمی بودن، نداشتن خاصیت ایمنی، اندازه کوچک، خاصیت مغناطیسی بالا، قابلیت تنظیم برای ارگان‌های هدف ویژه با تغییر در اندازه، ضخامت پوسته، شیمی سطحی و لیگاند هدف بیشتر استفاده می‌شوند. در کاربردهای in vivo نانوذرات آهن اکسید مگمیت و مگنیت به عنوان عوامل کنتراست در تصویرسازی‌های MRI و NMR استفاده می‌شود[۱۳] این ترکیبات تصویر حاصل از MRI و NMR بافت هدف را در نتیجه به هم زدنRelaxation Time آب اطراف تیره‌تر از سایر قسمت‌ها می‌کنند و در شرایط in vivo بافت‌هایی مثل کبد، طحال، مغز استخوان و گره‌های لنفاوی که حاوی ماکروفاژ بیشتری هستند عوامل کنتراست مغناطیسی را بیشتر به دام می‌اندازند و از این خاصیت در داخل بدن برای پیگیری بیماری‌های این اعضا، به‌خصوص موارد التهابی به‌صورت فرایندهای فیزیولوژیک استفاده می‌کنند. چون در بافت‌های سرطانی، این فرایندهای فیزیولوژیک ماکروفاژها را جذب نمی‌کنند پس در NMR رنگ درخشانتری را نشان می‌دهند

[۱۴]. به منظور افزایش ویژگی پروب‌های نانوذرات مغناطیسی به بافت هدف، لیگاندهای خاص مولکول یا بافت هدف همراه با یکسری عوامل در سطحشان که به آنها اجازه عبور از سلولها را می‌دهند طراحی می‌گردند[ ۱و۱۴]. از نانوذرات مغناطیسی در ایمنواسی‌ها نیز استفاده می‌شود[ ۱۳و۱۴].

Magnetorelaxometry، روشی است برای سنجش که ویسکوزیسته مغناطیسی یا Relaxation حرکت مغناطیسی یک سیستم نانوذره مغناطیسی را پس از خاموش کردن میدان مغناطیسی اندازه‌گیری می‌کند. در این سنجش‌ها آنتی‌ژن‌های هدف در سوسپانسیونی از آنتی‌بادی نشاندار با مگنت مخلوط می‌گردند و با اعمال یک میدان مغناطیسی، ذرات نانو خاصیت مغناطیسی خالص پیدا کرده که با خاموش کردن میدان مغناطیسی،Relaxation پیدا می‌کنند. تشخیص اتصال پروب به مولکول هدف با استفاده از تمایز فرایندهایRelaxation به دست می‌آید؛ نانوذرات غیر متصل سریعاً چرخش براونی ( Brawnian) پیدا می‌کنند، در حالی که نانوذرات متصل به مولکول هدف به آهستگی دچار Relaxation Neel شده و یک حرکت مغناطیسی ایجاد می‌نمایند که آشکارساز (Dtector) آن را ثبت می‌گردد. این روش علاوه بر امکان‌پذیر ساختن توانایی تشخیص و تمایز نشانگرهای متصل و غیر متصل به مولکول هدف نیاز به جداسازی نمونه را نیز بر طرف ساخته و در نتیجه اجازه تشخیص همگن ماده را می‌دهد [۱۳و۱۵].

● نانوذرات سیلیکا

نانو ذرات سیلیکا؛ ذرات رنگی در اندازه‌های دو تا ۲۰۰ نانومتر هستند و ساختمانشان از تشکیل تعداد زیادی مولکول‌های رنگی در داخل یک ماتریکس سیلیکا است. سیگنال فلورسانس این ذرات ده هزار بار قوی‌تر از فلوروفورهای معدنی است و به خاطر نشر و درخشندگی زیادی که دارند کاندیدای خوبی برای آنالیزهای حساس به شمار می‌روند؛ به طوری‌که نیاز به آمپلی فیکاسیون قبلی نمونه را بر طرف می کنند. نانوذرات سیلیکا علاوه برآنالیزهای حساس، در تصویرسازی مولکولی و تشخیص همزمان چندین مولکول هدف با استفاده از مولکول‌های رنگی با اندازه‌های مختلف (و در نتیجه رنگ‌های مختلف) کاربرد دارند. پایداری و چگالی بالای سیلیکا ، جداسازی سانتریفوژی، تغییرات سطحی و دیگر فرایندهای آنالیز را راحت‌تر کرده است. از مزایای دیگر این ذرات، هیدروفوبیک بودن ساختمان آنهاست که باعث محافظت از حمله‌های میکروبی، تورم و یا تغییر منافذ آنها در اثر تغییر pH می شود[۱۶]. از خاصیت فلورسنتی بالای نانوسیلیکا برای تشخیص میکروارگانیسم‌ها و همچنین DNA و پروتئین در زمان سریع با حساسیت بالا استفاده می‌گردد[۱۶و۱۷]. این ذرات به‌دلیل داشتن مولکول‌های رنگی بیشتر در داخل ماتریکس سیلیکا، سیگنال هیبرید خیلی قوی نسبت به نانوذرات قبلی مورد اشاره شده ایجاد می‌کنند[۱۶].

با استفاده از انواع مختلف رنگ‌های داخل ماتریکس که دارای غلظت‌های مختلف هستند، می‌توان نانوذرات بارکدینگ Substrate) -Barcoding) ایجاد کرد که مشخصات نوری ویژه‌ای دارند، این نانوذرات قادر به شناسایی همزمان چندین مولکول زیستی را روی سطح سلول هدف هستند. [۱۶].

نانوذرات و آنتی‌بادی که با نسبت‌های مختلفی که دارند، به طور ویژه میکروسفرهای پوشیده با آنتی بادی ثانویه مربوطه را تشخیص می‌دهند، در نتیجه به طور همزمان فرایندهای تشخیص بین نانوذرات گنژوگه و مولکول‌های هدف مربوطه روی سطح سلول انجام می‌شود. وقتی که مخلوط نانوذرات- سلول از یک فلوسایتومتر عبور داده می‌شود هر کمپلکس نانوذرات- سلول فلورسانس ویژه‌ای را ایجاد می‌کند که مشخصه نانوذرات متصل شده و در نتیجه نمونه به خصوصی در ایجاد یک موجی ویژه محسوب می‌شود. از نانوذرات سیلیکا به‌دلیل داشتن خاصیت احیاکنندگی زیادشان به عنوان نشان‌های الکتروشیمیایی نیز استفاده می‌شود.

● نتیجه‌گیری

۱) ذرات نانو به عنوان Labels یا Tags، حساسیت، سرعت و انعطاف‌پذیری تست‌های بیولوژیکی که حضور یا فعالیت مواد مورد نظر را اندازه می‌گیرند افزایش می‌دهد.

۲) نانوذرات قادر به آزمایش نمونه‌های در حجم کم هستند.

۳) از بسیاری از روش‌های توصیف شده می‌توان برای DNA و پروتئین‌ها استفاده کرد.

۴) نانوذرات امکان تشخیص میکروارگانیسم‌ها یا مولکول‌هایی که به وسیله روش‌های رایج امکان‌پذیر نیست فراهم می‌سازند.

۵) تشخیص اولیه بیماری‌هایی از قبیل سرطان، بهبود و موفقیت درمان را بیشتر می‌کند.

۶) برخی از روش‌‌های اشاره شده نیاز نمونه به PCR را برطرف می‌کنند.

۷) نانوذرات با کاهش زمان مورد نیاز برای تست نمونه یک اثر مثبت روی تصمیم‌گیری‌های بالینی و هزینه‌های درمان دارند.

۸) پروب‌های نانوذرات امکان کاربری در تشخیص‌های in vivo را به‌خوبی دارا هستند.

۹) اکثر این ترکیبات غیر سمی یا سمیتشان خیلی پایین است.

منابع

۱-Natalia, C. T. and Zhiqiang, G. (۲۰۰۶) “Nanoparticles in biomolecular detection” Nanotoday ; ۱ (۱) : ۲۸-۳۷

۲-Salata, O. V. (۲۰۰۴) “Application of nanoparticles in biology and medicine” J. Nanobiotechnology; ۲ (۳) : ۱-۸

۳-Kewal, K. and Jain, T. (۲۰۰۵) ” Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics” Clinica Chimica Acta; ۳۵۸: ۳۷–۵۴

۴-Paolo, F. , Larry, J. and Saul, S. (۲۰۰۵) “Nanobiotechnology: the promise and reality of new approaches to molecular recognition” Trends in biotechnology ; ۲۳ (۴) : ۱۶۹-۱۷۳

۵- Shad, C. and Mirkin, C. A. (۲۰۰۵) “DNA-Gold-Nanoparticles Conjugates” In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) ,WILEY-VCH. pp. ۲۸۹-۳۰۷

۶- Shad, T. C. , Dimitra, G. and Mirkin, C. A. (۲۰۰۵) “Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acid targets” Clinica Chimica Acta. xx (۲۰۰۵) xxx – xxx

۷-Jwa, M. N. , Shad, C. and Chad, C. M. (۲۰۰۳) “Nanoparticle-Based Bio-barcodes for the Ultrasensitive Detecetion of proteins” Science ; ۳۰۱: ۱۸۸۴-۱۸۸۶

۸- Jwa, M. N. , Savka. I. S. and Chad A. M (۲۰۰۴) “Bio-Bar-Code-Based DNA Detection with PCR-like Sensitivity” J. Am. Chem. Soc ; ۱۲۶ (۱۹) : ۵۹۳۲ -۳

۹-Park,S. J. and Chad, C. M. (۲۰۰۲) “Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle probes” Science ; ۲۹۵: ۱۵۰۳۱۵۰۶

۱۰- Xiaohu, G. , Yang, L. , John A P. and Marshall, F. (۲۰۰۵) “In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots” Current |Opinion in Biotechnology ;۱۶: ۶۳-۷۲

۱۱- Xiaoho,G. and Shuming,N. (۲۰۰۵) “Luminescent Quantum Dots for biological Labeling” In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) , WILEY-VCH. pp. ۳۴۳-۳۴۱

۱۲-Wu X, L. H. , and Liu, J. (۲۰۰۳) “Immunofluorescent labeling of

cancer marker Her۲ and other cellular targets with semiconductor

quantum dots” Nat. Biotechnol. ;۲۱: ۴۱– ۶.

۱۳-Pedro,T. , Maria, D. and Morale, P. (۲۰۰۳) “The preparation of magnetic nanoparticles for application in biomedicine” J. Phys. Appl. Phys;۳۶: R۱۸۲-R۱۹۷

۱۴- Conte,L. , Nitin ,N. and Gang, B. (۲۰۰۵) “ Magnetic nanoparticle probes” Nanotoday ;may ۲۰۰۵: ۳۲-۳۸

۱۵-E. Romanus, M. , Hückel, C. and Weitschies, R. (۲۰۰۳) “Magnetic nanoparticle relaxation measurement as a binding specific technique for in vivo diagnostics” file: //F: \\nnn\\Nanoparticle Symposium May ۲۰۰۳- Abstracts.

۱۶- Wang,L. , Kemin, W. , Swadeshmukul, S. ,Xiaojun, Z. Yanrong, W. (۲۰۰۶) “Watching Silica Nanoparticles” Anal. Chem ;February ۱: ۶۴۶-۶۵۴

۱۷- Zhao, X. , Lisa R. Hilliard*, Mechery,S. J. , Wang ,Y. ,Rahul, P. and Jin, Sh. (۲۰۰۴) “ A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation

using bioconjugated nanoparticles” PNAS;۱۰۱ (۴۲) : ۱۵۰۲۷-۱۵۰۳۲etic